Odolnost stárnoucích buněk k apoptóze je vnitřní bariérou pro senolýzu indukovanou srdečními glykosidy, část 2
Jul 26, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
Narušení homeostázy K*/Nat způsobené ouabainem vede k různým fyziologickým reakcím u kontrolních a senescentních A549 a END-MSC
Po zjištění skutečnosti, že senolytický účinek ouabainu je závislý na typu buňky, jsme se dále pokusili objasnit, co může být základem odhalených rozdílů v odpovědích hMSC a A549. Za tímto účelem jsme analyzovali stárnutí END-MSC a etoposidu vyvolané oxidativním stresem. -přesněji indukované stárnutí A549.výhody cynomoriumHlavním molekulárním mechanismem účinku různých srdečních glykosidů je inhibice Nat/K plus -ATPázy [44]. Nat/K plus -ATPáza je enzym plazmatické membrány, který pumpuje sodík ven z buňky a zároveň pumpuje draslík do buňky proti koncentračním gradientům a podílet se tak na udržování homeostázy K plus a Na plus. Proto jsme se zeptali, zda mohou existovat nějaké rozdíly v bazální a ouabainem indukované iontové homeostáze mezi kontrolními a senescentními buňkami dvou typů.
Porucha homeostázy K plus a Na plus způsobená ouabainem by měla nakonec vést k disipaci potenciálu plazmatické membrány. Dále jsme tedy použili specifickou fluorescenční sondu DiBAC4(3) k měření transmembránového potenciálu neexcitabilních buněk. Zvýšená fluorescence tohoto barviva odráží depolarizaci membrány.pouštní hyacintV každém testovaném typu buňky ouabain vyvolal předvídatelnou depolarizaci membrány, což potvrzuje iontovou nerovnováhu (obr. 10a). Pozoruhodně jsme pozorovali srovnatelné úrovně depolarizace membrány v kontrolních a senescentních END-MSC, zatímco senescentní A549 se vyznačovala významně více depolarizovanou membránou ve srovnání s kontrolními buňkami A549.
Dalšími důležitými důsledky iontové deregulace jsou změny v mitochondriálním membránovém potenciálu (MP).
S použitím fluorescenční sondy JC-1 jsme tedy hodnotili MMP v kontrolních a senescentních buňkách po ošetření ouabainem. Je třeba konkrétně zdůraznit, že senescentní buňky jsou běžně charakterizovány sníženou MMP, která odráží nesprávné fungování mitochondrií, změny v energetickém metabolismu a zvýšené hladiny intracelulárních reaktivních forem kyslíku[45]. Jak se očekávalo, MMP v senescentních END-MSC a A549 buňkách byla nižší než v kontrolních,
ačkoli tento pokles neovlivnil životaschopnost senescentních buněk (obr. Id, 6a, 10b).Metoda extrakce flavonoidů pdfPodobně jako u výše uvedených výsledků indukoval ouabain výraznou depolarizaci MMP u senescentních A549 ve srovnání s jejich proliferujícími protějšky, zatímco účinek na MMP u kontroly a senescentních END-MSC byl minimální (obr. 10b). Shrneme-li výsledky popsané v této části, můžeme dojít k závěru, že blokování Na plus /K plus -ATPázy ouabainem vede k dramatické depolarizaci plazmatické membrány a poklesu MMP v případě senescentního A549, na rozdíl od senescentního END-MSCS.
Změny v mechanismech K plus importu zprostředkovávají ouabainovou rezistenci senescentních END-MSC
Abychom objasnili mechanismy zprostředkovávající ouabainem indukované změny v membránové polarizaci a MMP mezi senescentními A549 a END-MSC, dále jsme použili pokročilý bioinformatický přístup. Cílem analýzy bylo odhalit možné transkriptomické rysy zprostředkovávající buněčnou rezistenci vůči ouabainu nebo citlivost senescentních buněk. Jinými slovy, položili jsme otázku: jak se liší senescence END-MSC (buňky rezistentní na ouabain) od senescence A549 (buňky citlivé na ouabain)? K zodpovězení této otázky jsme použili tři nezávislé datové soubory sekvenování RNA (RNA-Seq). První z nich byla analýza RNA-Seq
Obr. 6 Validace modelu stárnutí A549 indukovaného etoposidem. Senescentní buňky A549 vykazují ztrátu proliferace, b získávají zvýšenou velikost buněk, c úroveň autofluorescence a d SA-b-Gal aktivitu ve srovnání s kontrolními. e Hladiny fosforylace p53 a Rb a hladiny exprese proteinů p21 a HMGBI v kontrolním a senescentním A549. Uvedené hodnoty jsou průměr ± SD. Pro více skupin byla použita srovnání na jednosměrné analýze ANOVA, n=3, ns nevýznamné,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c,="" and="" d="" welch's="" test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001.>flavonoidyMěřítko obrázků je 500 μm. GAPDH byl použit jako kontrola načítání kontrolních a senescentních END-MSC, které jsme provedli. Druhým byl datový soubor pro kontrolní a senescentní A549 stažený z GEO [43]. Je třeba poznamenat, že stavy vyvolávající stárnutí se shodovaly s těmi, které byly použity v této studii a v pilotních studiích senolýzy indukované srdečními glykosidy. A třetí soubor dat byl pro kontrolu a senescentní IMR-90 získaný přímo ze studie srdečních glykosidů jako senolytických sloučenin [25]. Důležité je, že IMR-90 bylo prokázáno jako náchylné k analýze vyvolané ouabainem. Je třeba poznamenat, že porovnávání pouze dvou datových souborů relevantních pro END-MSC a A549 by nakonec vedlo k nesprávným výsledkům, protože v takové analýze by byl hledaný rozdíl mezi procesem stárnutí v END-MSC a A549 nerozeznatelný od variací zprostředkovaných různé technické dávkové efekty (tj. typ sekvenačního stroje, podmínky běhu vzorku). Abychom minimalizovali jakékoli účinky šarže, porovnali jsme jeden soubor dat pro buňky rezistentní na ouabain (END-MSC) a dva pro buňky citlivé na ouabain (A549, IMR-90). Abychom ověřili relevanci další srovnávací analýzy, provedli jsme analýzu hlavních složek pro podskupinu genů souvisejících s termínem GO "buněčné stárnutí" (GO 0090398) na základě souhrnného souboru dat obsahujícího vzorky ze všech tří popsaných experimentů. Ve skutečnosti se vzorky pro každý typ buněk seskupily do dvou samostatných skupin – kontrolní a senescentní (obr. 10d).
cistanche může proti stárnutí
Pro provedení analýzy diferenciálně exprimovaných genů (DEG) během stárnutí buněk rezistentních a citlivých na ouabain jsme vytvořili statistický model, který shrnul dva prediktory a jejich interakci. Schematické znázornění analýzy je zobrazeno na obr. 10c. Stručně řečeno, první prediktor v modelu rozdělil všechny vzorky podle kontrolních a senescenčních podskupin, druhý podle rezistence na ouabain nebo citlivosti na ouabain a poslední složka v modelu odrážela interakce obou prediktorů. Výsledek testování diferenciální exprese pro poslední proměnnou je uveden v doplňkové tabulce 1.
Poté jsme provedli analýzu obohacení genové sady (GSEA) v termínech genové ontologie (GO) pro biologické procesy (BP) (doplňková tabulka 2). Mezi významně obohacenými procesy jsme zjistili, že „import draslíkových iontů“ a „pozitivní regulace transmembránového transportu kationtů jsou up-regulovány během stárnutí END-MSC rezistentních na ouabain ve srovnání se stárnutím buněk citlivých na ouabain (obr. 10e ). Seznamy hlavních obohacených genů související s těmito procesy zahrnovaly KCNJ2, KCNJ14, KCNJ8, SLC12A7, SLC12A8, WNK4, které byly významně upregulovány v senescentních END-MSC (obr. 10f). Proteiny kódované geny KCNJ jsou draslíkové kanály typu dovnitř usměrňovače, které mají větší tendenci umožnit draslíku proudit do buňky spíše než ven z buňky.používá hesperidinSLC12 rodina kationtových přenašečů chloridů. Gen WNK4 kóduje serin/threonin kinázu, která působí jako aktivátor chloridových kotransportérů vázaných na sodík a inhibitor chloridových kotransportérů vázaných na draslík. Společně tato zjištění umožnila naznačit, že senescentní END-MSC mohou obnovit vyčerpané intracelulární hladiny K plus efektivněji než senescentní buňky A549, a tak si mohou poradit s iontovou nerovnováhou vyvolanou ouabainem.
Senescentní END-MSC zobrazují zvýšené
rezistence vůči apoptóze ve srovnání s kontrolními, zatímco senescentní A549 nikoli
Úloha intracelulárního K plus v regulaci buněčné smrti je dobře známá [46]. Odhalené rozdíly mezi senescentními END-MSC a buňkami A549 ve schopnosti udržovat intracelulární K plus homeostázu nás přiměly porovnat celkovou odolnost vůči stresu získanou během stárnutí obou typů buněk. Je známo, že exogenní stresy jsou doprovázeny poruchou iontové homeostázy, což vede k rychlé výměně různých iontů, včetně K plus, mezi buňkou a jejím prostředím [46]. Výsledky stresových vlivů jsou do značné míry závislé na schopnosti buněk obnovit vhodnou intracelulární iontovou rovnováhu. Jak je znázorněno na obr. 10e, f, stárnutí END-MSC bylo doprovázeno upregulací K plus importu, což naznačuje, že během
Obr. 10 Senescentní END-MSC rezistentní na ouabain jsou schopny obnovit narušení homeostázy K plus/Nat způsobené ouabainem prostřednictvím účinného importu K plus, zatímco senescentní buňky citlivé na ouabain tuto schopnost postrádají. a Stanovení membránového potenciálu kontrolních a senescentních END-MSC a buněk A549 před a 24 hodin po ošetření ouabainem pomocí fluorescenční sondy DiBAC4(3). b Hodnocení potenciálu mitochondriální membrány kontrolních a senescentních END-MSC a buněk A549 před a 24 hodin po ošetření ouabainem pomocí fluorescenční sondy JC-1. c Návrh komparativní bioinformatické analýzy tří nezávislých datových souborů RNA-Seq.d Analýza hlavních komponent pro podskupinu genů souvisejících s termínem GO „buněčné stárnutí“ (GO 0090398) na základě kombinovaných dat ze tří nezávislých datových souborů RNA-Seq . Výsledky GSEA pro odlišně exprimované geny mezi buňkami odolnými vůči analýze zprostředkované ouabainem (END-MSC) a buňkami citlivými na analýzu zprostředkovanou ouabainem (A549 a IMR-90) pro „pozitivní regulaci transmembránového transportu kationtů“ a Biologické procesy importu iontů draslíku. f Teplotní mapa odrážející geny obohacení jádra pro biologické procesy „Pozitivní regulace transmembránového transportu kationtů“ a „Import iontů draslíku“. Hodnoty jsou střední ± SD. Statistická významnost byla hodnocena Studentovým t-testem: ns nevýznamné,*p<><><>
vývoj stárnutí END-MSC zvyšují jejich schopnost obnovit hladiny K plus. Je zajímavé, že jsme nebyli schopni odhalit podobnou tendenci k senescenci A549, takže se zdálo, že A549 nezískal žádné specifické rysy související s importem K* během progrese stárnutí. Podle literárních údajů stresem indukovaný pokles intracelulárního K* a neschopnost obnovit jeho hladinu podporuje aktivaci kaspáz a nukleáz, a proto se předpokládá, že jde o proapoptotický faktor [46].
V souladu s tímto návrhem jsme pomocí bioinformatické analýzy výše uvedených datových souborů RNA-seq odhalili významnou down-regulaci procesů souvisejících s apoptózou během stárnutí END-MSC ve srovnání s A549 a IMR-90 (obr. lla) . Senescence A549 a IMR-90 je navíc charakterizována významnou up-regulací proapoptotických genů, včetně BAD, BAX, BOK, BAK-1 a NOXA (obr. 11b). Tato data naznačují, že END-MSC získávají fenotyp odolný vůči apoptóze během stárnutí, zatímco senescentní IMR-90 a A549 se staly náchylnými k apoptóze (obr. 11b). Abychom toto pozorování posílili, dále jsme analyzovali datový soubor mikročipů pro kontrolní a replikativní senescentní AD-MSC, které si také zachovaly rezistenci vůči ouabainu během stárnutí, jak je uvedeno výše (obr. 4g). Při analýze úrovní exprese genů souvisejících s apoptózou jsme pozorovali odlišný fenotyp senescentních AD-MSC odolných vůči apoptóze podobný fenotypu senescentních END-MSC (doplňkové obr. S8a, b).
Abychom ověřili výsledky transkriptomické analýzy, odhadli jsme hladiny exprese genů souvisejících s apoptózou a importem K plus v obou typech senescentních buněk – END-MSC a A549 pomocí RT-PCR (doplňkový obr. S9). Kromě toho jsme analyzovali expresi stejného seznamu genů pomocí jiných buněčných modelů rezistentních na ouabain a citlivých na ouabain, senescentních DP-MSC ošetřených doxorubicinem a senescentních SK-Help ošetřených etoposidem (doplňkový obr. S9). Jak je znázorněno na doplňkovém obr. S9, oba typy senescentních END-MSCs rezistentních na ouabain a DP-MSC vykazovaly podobné vzorce genové exprese, konkrétně KCNJ2, SLC12A a WNK4 účastnící se obnovy K plus byly upregulovány, proapoptotický BAX byl downregulován, zatímco antiapoptotický MCL-I byl upregulován. Kromě toho se vzor exprese stejných genů lišil od vzorců pozorovaných pro A549 a SK-Hep1 citlivé na ouabain. Tyto výsledky potvrzují naše transkriptomická data a posilují závěr týkající se různých profilů apoptózy získaných během stárnutí různých typů buněk.
Dále jsme testovali, zda pozorované rozdíly v pozadí apoptózy během stárnutí END-MSC a A549 mohou mít dopad na celkovou odolnost senescentních buněk vůči stresu. Abychom tak učinili, hodnotili jsme životaschopnost buněk po oxidativním stresu a staurosporinu, typicky aplikovaných k indukci apoptózy. Ukázalo se, že senescentní END-MSC jsou výrazně odolnější vůči oběma namáháním ve srovnání s jejich kontrolními protějšky (obr. 1lc). Naopak buňky A549 demonstrovaly opačnou situaci, protože senescentní buňky vykazovaly tendenci být citlivější vůči stresem indukované buněčné smrti (obr. 11d). Toto pozorování posouvá stávající paradigma, že zvýšená odolnost proti smrti je společným rysem jakéhokoli druhu senescentních buněk, což prokazuje jeho zřejmou buněčnou specifitu.
Na základě výše uvedených dat jsme předpokládali, že snížení „obrany“ apoptózy senescentních END-MSC by mělo vytvořit příznivé podmínky pro další analýzu. V tomto ohledu jsme se zaměřili na dobře známého antiapoptotického člena rodiny proteinů BCL-2 – MCL-1, protože jeho exprese byla upregulována v senescentních END-MSC rezistentních na apoptózu (obr. 1lb a doplňkový obr. S9a). Za tímto účelem jsme předem ošetřili kontrolní a senescentní END-MSC s A-1210477 specifickým MCL-1 inhibitorem a poté jsme aplikovali srdeční glykosidy k vyvolání analýzy. Je třeba poznamenat, že samotný A-1210477 neměl žádný vliv na proliferační kapacitu kontrolních buněk a na životaschopnost senescentních buněk, jak je uvedeno na růstových křivkách (obr. 1le). Následná aplikace srdečních glykosidů vedla ke snížení počtu životaschopných buněk, avšak efekt byl výraznější u senescentních ESC (obr. 11f). Proto inhibice MCL-1 pomocí A-1210477 predisponovala senescentní ESC ke smrti vyvolané ouabainem, což indikovalo analýzu. Poslední důkaz rezistence k apoptóze získaný během senescence END-MSC je vnitřní bariérou pro účinnou analýzu spouštěnou srdečními glykosidy.
Diskuse
V rámci této studie jsme testovali senolytické účinky srdečních glykosidů, jmenovitě ouabainu a bufalinu, na hMSC. U obou sloučenin bylo nedávno identifikováno, že mají selektivní cytotoxický účinek na senescentní buňky (modely stárnutí vyvolané onkogenem/therapy) různého původu, včetně primárních buněk IMR-90,HUVEC, ARPE-19,T/ C-28 a rakovinné buňky SK-Help,A549,SK-Mel-5,MCF7,HCT116, HaCat,H1299,U373-MG,H1755[25,26]. Neočekávaně jsme nebyli schopni odhalit žádné preferenční cytotoxické účinky ani ouabainu, ani bufalinu na senescentní END-MSC ve srovnání s kontrolními. Důležité je, že absence analýzy byla ověřena pomocí hMSC získaných z tukové tkáně, zubní dřeně a Wartonova želé a různých modelů stárnutí. To nás přivedlo k návrhu, že rezistence na analýzu indukovanou srdečními glykosidy může být společným rysem hMSC. Zároveň se nám podařilo navodit apoptózu přednostně u senescentních A549 a SK-Help, a tím reprodukovat senolytický účinek srdečních glykosidů popsaný v příslušných článcích [25,26]. S dostupnými buňkami rezistentními a citlivými na analýzu indukovanou ouabainem (rezistentní na ouabain/citlivé na ouabain) jsme se pokusili objasnit základní příčiny tohoto rozdílu. Společným molekulárním mechanismem působení srdečních glykosidů je vazba na Nat/K plus -ATPázu a blokování její aktivity. Hydrolýzou ATP tento enzym zajišťuje čerpání Na plus z buňky a import K plus do buněk, a tak udržuje fyziologický elektrochemický gradient, iontovou homeostázu, buněčné pH a objem buněk, které jsou nezbytné pro přežití a fungování buněk [47]. Proto jsme spekulovali, že senolytická schopnost ouabainu může záviset na závažnosti nerovnováhy K plus/Nat v ošetřených buňkách. V souladu s tímto návrhem jsme odhalili, že ouabain indukoval výraznější depolarizaci plazmatické membrány a pokles MMP u senescentního A549 citlivého na ouabain.
Obecně řečeno, dopad inhibice Nat/K plus -ATPázy na přežití buněk se ukázal jako specifický pro buněčný typ. Například bylo prokázáno, že ouabain potencuje apoptózu v lymfocytech, Jurkatových buňkách a psích epiteliálních buňkách, zatímco nedokázal vyvolat smrt v epiteliálních buňkách z potkaní aorty, potkaních cerebrálních granulárních buněk a prasečích ledvinových proximálních tubulárních LLC-PK1 lymfocytů navzdory podobné modulaci kationtového poměru [48-54]. Jedním z navrhovaných mechanismů proapoptotického působení ouabainu je deplece intracelulární tkáně, která podporuje apoptotické smrštění, aktivaci kaspáz a zahájení apoptotického programování [46, 47]. S ohledem na srovnatelnou ztrátu K plus, ale opačný účinek na indukci smrti získaný pro modely rezistentní na ouabain a citlivé na ouabain, jsme navrhli rozdíly v kompenzačních systémech kationtů. Pokles intracelulární hladiny K plus by měl v podstatě vést k aktivaci importu K plus z extracelulárního prostoru, aby se kompenzoval nedostatek tohoto kationtu. Účinnost obnovy K plus tedy může být základem predispozice k apoptóze po léčbě ouabainem. K testování tohoto návrhu jsme použili komplexní bioinformatickou analýzu porovnávající změny v transkriptomických signaturách během stárnutí buněk rezistentních na ouabain (END-MSC) a buněk citlivých na ouabain (A549 a IMR-90). Pozorovali jsme silnou upregulaci procesů souvisejících s importem draselných iontů během senescence END-MSC, zatímco během senescence A549 a IMR-90 citlivých na oua-bain tyto procesy zůstaly nezměněny nebo dokonce sníženy. Na základě toho můžeme spekulovat, že senescentní END-MSC se mohou účinně vyrovnat s deplecí K plus vyvolanou ouabainem prostřednictvím aktivních systémů importujících kationty, které brání indukci apoptózy. Naproti tomu senescentní A549 a IMR-90 citlivé na naše bain se zdají být méně schopné překonat ztrátu K plus, a proto jsou náchylné k apoptóze. Ve prospěch tohoto předpokladu indukoval ouabain významnější depolarizaci plazmy a mitochondriálních membrán v senescentní buňky A549, vykazující výraznou iontovou nerovnováhu typickou pro umírající buňky.
Spíše než jedinečným rysem apoptózy indukované ouabainem je pokles intracelulárního obsahu K plus pravděpodobně běžnou charakteristikou apoptotické smrti vyvolané různými stresy, např. léčbou staurosporinem a oxidativním stresem [46]. Snížená schopnost senescentního A549 obnovit cytoplazmatický K plus by tedy měla nakonec vést k poklesu celkové odolnosti vůči stresu. Tato představa je však v rozporu s moderní definicí buněčného stárnutí, která uvádí, že senescentní buňky jsou vysoce odolné vůči apoptóze [16]. Je třeba konkrétně zdůraznit, že zvýšená odolnost proti apoptóze tvořila základ pro vývoj analytiky [16, 17].
První zmínka o zvýšené odolnosti senescentních buněk vůči stresu pochází z roku 1995, kdy bylo zjištěno, že replikativní senescentní fibroblasty jsou odolnější vůči odebrání séra ve srovnání s kontrolními [55]. Po této počáteční studii následoval omezený počet výzkumů, které naznačovaly, že senescentní buňky jsou odolnější vůči UV záření, staurosporinu, thapsigarginu a dalším stresům než jejich proliferující protějšky [56, 57]. Nejsme však zdaleka první, kdo vznesl otázku zvýšené odolnosti vůči apoptóze jako obecného rysu senescentních buněk. V přehledu publikovaném v roce 2003 se tedy uvádí, že „... rezistence na apoptózu není obecným rysem senescentních buněk, které mohou být také náchylné k apoptóze v závislosti na typu buněk a apoptotických stimulech...“[58]. Několik údajů skutečně prokázalo vyšší citlivost senescentních buněk na stresem indukovanou apoptózu než kontrolní buňky [59-61]. Například senescentní buňky HUVEC byly ve srovnání s kontrolními buňkami náchylnější k apoptóze indukované oxidovaným LDL nebo TNFa[61]. Navzdory zjevné kontroverzi se poslední pochybnost objevila v roce 2015 a zněla takto: „Zdá se pochybné, že globální rezistence na apoptózu je obecným rysem buněk stárnutí“[62]. Ve stejném roce byla publikována první studie odhalující analýzu [16] ]. V rámci této studie autoři zdůraznili zvýšenou expresi pro-survival genových sítí v senescentních buňkách, která přispěla k jejich zvýšené odolnosti vůči apoptóze. Zpočátku tedy senolytika představovala léky k zacílení proteinů, které chránily senescentní buňky před apoptózou. Objev analytických metod spolu s působivými výsledky odstraňování senescentních buněk pomocí transgenních myší INK-ATTAC spustil příval studií, které hledaly nové sloučeniny s hemolytickou aktivitou [16-26,63]. Za poslední dva roky bylo publikováno mnoho recenzí o analýze [13-15,64-66]. Od roku 2015 však zvýšená odolnost senescentních buněk vůči apoptóze nebyla předmětem diskuse, i když ve skutečnosti nebyla v rámci těchto studií testována.
Je zajímavé, že při porovnávání transkriptomických signatur buněk rezistentních na ouabain (END-MSC) a buněk citlivých na ouabain (A549 a IMR-90) jsme zjistili, že pouze stárnutí END-MSC bylo doprovázeno získáním znatelných antiapoptotický profil. Senescence A549 a IMR-90 je naopak charakterizována významnou up-regulací proapoptotických genů, včetně BAD, BAX, BOK, BAK-1, NOXA a tak dále. Důležité je, že tyto výsledky byly rozšířeny pomocí dalších buněk DP-MSC rezistentních na ouabatin. Na jedné straně tyto výsledky poskytují další molekulární vysvětlení absence ouabainem indukované analýzy v hMSC a na druhé straně jasně ukazují, že A459 a IMR-90 se stávají predisponovanými k apoptóze během stárnutí. Je třeba poznamenat, že naše údaje týkající se transkriptomických změn v genech souvisejících s apoptózou u senescentního IMR-90 se shodovaly s výsledky prezentovanými, ale nediskutovanými v článku publikovaném Guerrerem et al., jako soubory dat pro kontrolu a senescentní IMR{ {19}} buněk pocházelo z této studie [25]. Přesná analýza tepelné mapy poskytnuté v rámci této studie odhalila upregulaci BAX, BAD, BAD, BAKI a NOXA v senescentní IMR-90 ve srovnání s kontrolními buňkami. Kromě toho Baar a kol. také odhalili „neočekávanou“ upregulaci proapoptotických a downregulaci antiapoptotických genů u senescentního IMR-90, přičemž zmínili, že senescentní IMR-90 by mělo být připraveno k apoptóze [21].
Abychom posílili naše pozorování, porovnali jsme rezistenci kontrolních a senescentních END-MSC a A459 k nejběžnějším stimulům indukujícím apoptózu-oxidačnímu stresu a staurosporinu. Podle výsledků naší bioinformatické analýzy se senescentní END-MSC ukázaly být mnohem odolnější vůči stresu než kontrolní buňky. Senescentní A549 zároveň prokázal opačnou reakci, která byla o něco citlivější než kontrolní buňky na oba typy stresových podnětů. Senolytický účinek srdečních glykosidů, alespoň pro A549, by tedy mohl být zprostředkován predispozicí senescentních buněk tohoto původu k apoptóze ve srovnání s jejich kontrolními protějšky, zatímco nepřítomnost senolýzy indukované ouabainem v hMSC může být vysvětlena zvýšením celkovou apoptotickou rezistenci během stárnutí těchto buněk. Navíc oslabení "antiapoptotické obrany" inhibicí MCL-1 predisponovalo END-MSC k senolýze vyvolané srdečními glykosidy. I když jsme byli schopni dosáhnout požadované senolýzy END-MSC inhibicí MCL-1, strategie modulace exprese konkrétních antiapoptotických genů k predisponování senescentních hMSC k senolýze se nezdá příliš slibná, protože exprese dynamika konkrétních anti- nebo pro-apoptotických genů se může mezi buňkami různého původu lišit. Domníváme se, že za rezistenci na ouabain je zodpovědné získání takzvaného „antiapoptotického“ profilu během stárnutí buňky, spíše než změny v konkrétních anti- nebo proapoptotických genech, v tomto ohledu by mohla možnost změnit celý profil zdají rozumnější.
Naše závěry zdůrazňující odolnost vůči apoptóze získanou během stárnutí hMSC jako vnitřní bariéru pro účinnou analýzu by mohly být rozšířeny daleko za srdeční glykosidy. Bylo zjištěno, že senescentní hMSC jsou odolné vůči jiným senolytickým sloučeninám. Analýzou existujících důkazů jsme skutečně zjistili, že různé sloučeniny s uvedenou senolytickou aktivitou, včetně navitoclaxu, nikotinamid ribosidu, danazolu geldanamycinu, ganetespibu, fisetinu, inhibitorů BCL-XL, kvercetinu, etomoxiru, antimycinu A, FOXO4-DRI ,17-DMAG se ukázal jako neúčinný pro cílené odstranění senescentních lidských preadipocytů (prekurzorových buněk podobných fibroblastům pocházejících z lidské tukové tkáně) a hMSC z kostní dřeně [17-19, 36, 40]. Údaje týkající se absence analýzy v hMSC jsou poněkud v rozporu s inspirativními výsledky získanými pomocí in vivo myších modelů, které prokazují pozitivní výsledky při systémové aplikaci analytiky [37, 38]. Bylo například prokázáno, že odstranění senescentních kmenových buněk slinných žláz pomocí ABT263 může zabránit xerostomii vyvolané radioterapií [38]. Kromě toho odstranění senescentních MSC kostní dřeně pomocí kvercetinu zlepšilo tvorbu kostní dřeně [37]. Důležité je, že se ukázalo, že senescentní myši a krysí MSC na rozdíl od hMSC reagují na analýzy. Například quercetin, quercetin-tin＋dasatinib a ABT263 významně odstranily senescentní myší MSC [16]. Také bylo prokázáno, že 17-DMAG výrazně snižuje senescentní bmMSC v modelu progeroidních myší [19]. Proto se předpokládá, že zlepšení fungování různých orgánů a systémů popsané v těchto studiích je důsledkem cíleného odstranění senescentních myších kmenových buněk. Tyto analýzy však dosud neprokázaly žádné funkční omlazení hMSC. Takový zřejmý rozdíl mezi citlivostí myší a lidských MSC na analýzu naznačuje, že zlepšení ze senolytických terapií nemusí být u druhů zachováno. Výsledky získané pro senolytickou sloučeninu UBX0101 lze považovat za dobrou ilustraci potvrzující poslední tvrzení. Bylo prokázáno, že toto činidlo čistí senescentní buňky na myším modelu osteoartrózy, což významně snižuje bolest a podporuje opravu poškozené chrupavky [20]. Bohužel UBX0101 nedokázal zmírnit progresi onemocnění a bolest u pacientů se středně těžkou až těžkou bolestivou osteoartrózou během klinických studií fáze II [67-69]. Podobné obavy panují u senolytické kombinace dasatinib＋querce-tin[68].
V souhrnu ze získaných dat plynou dva důležité závěry. První z nich prokázala, že srdeční glykosidy nejsou schopny vyčistit senescentní hMSC. Absence analýzy může být zprostředkována účinným buněčným importem K plus a zvýšenou odolností vůči apoptóze u senescentních hMSC. Posledně jmenovaný je zásadnější a odhaluje, že rezistence na apoptózu není obecným rysem senescentních buněk, protože během stárnutí některé buňky získávají fenotyp „odolný vůči apoptóze“, zatímco jiné nikoli. Důležité je, že pouze senescentní buňky A549 náchylné k apoptóze mohly být účinně vyčištěny srdečními glykosidy. Na základě toho můžeme spekulovat, že účinnost jiných senolytických přístupů může záviset na tom, zda jsou senescentní buňky skutečně odolné vůči apoptóze ve srovnání s jejich proliferujícími protějšky. A konečně, i když je „analytika“ horké téma a je publikováno mnoho inspirativních dat, závěry týkající se účinnosti analýzy by měly být brány s opatrností, protože heterogenita stárnutí buněk stále zůstává „hádankou“.
Tento článek je převzat z Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x
