Antioxidant Grafen Oxid Nanoribbon jako nové bělící činidlo inhibuje mechanismus melanogeneze

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hsin-Yu Chou, Hui-Min David Wang,* Chia-Heng Kuo, Pei-Hsuan Lu, Lin Wang, Wenyi Kang a Chia-Liang Sun*

ABSTRAKTNÍ:V procesu syntézy melaninu hrají zásadní roli oxidační reakce a je dobrou strategií inhibovat produkci melaninu snížením oxidačního stresu. Fulleren a jeho deriváty nebo komplexy byly považovány za silné lapače volných radikálů a dále jsme použili vícevrstvé sp2 nanokarbony, abychom objevilimelaninmechanismy inhibice syntézy. V této studii jsme jako antioxidační činidla pro regulaci produkce melaninu použili nové nanomateriály, jako jsou vícestěnné uhlíkové nanotrubice (MWCNT), MWCNT krátkého typu, nanoribbony oxidu grafenu (GONR) a GONR krátkého typu. Výsledky ukázaly, že GONR mají lepší antioxidační schopnosti v platformách pro analýzu intracelulárního a extracelulárního oxidačního stresu než ostatní. Navrhli jsme, že GONR mají funkční skupiny obsahující kyslík. V testu 2',7'-dichlordihydrofluorescein diacetátu jsme zjistili, že GONR může chelatovat kovové ionty, aby vychytal reaktivní formy kyslíku. V pohledu na molekulární vhled jsme pozorovali, že tyto nanomateriály downregulovaly syntézu melaninu snížením exprese genů souvisejících s transkripčním faktorem souvisejícím s mikroftalmií a podobné důsledky byly v expresi proteinů. Stručně řečeno, GONR jsou potenciálním činidlem jako nový antioxidant a kosmetický materiál pro bělení pokožky.

Cistanche je taképotenciální agent jako románantioxidanta bělení kůžekosmetický materiál.

1. ÚVOD

Kůže je orgán, který pokrývá vnější povrch lidského těla. Vzhledem k tomu, že rozhraní je v kontaktu s prostředím, hraje vrstva kůže důležitou roli při ochraně těla před patogeny, zamezení nadměrné ztrátě vody, regulaci tělesné teploty a tak dále. Melanocyty rostou v bazální membráně kožní epidermis a tvoří 5 až 10 procent buněčného obsahu. Byly charakterizovány jako jednobuněčné "žlázy" s tenkými, dlouhými, streamerovitými dendrity a větvením. Melanocyty se pohybují epidermálními buňkami v jejich bezprostřední blízkosti a vytvářejí konstelaci epidermálních buněk kolem každého melanocytu. Existuje mnoho vnitřních a vnějších příčin stárnutí kůže a jedním z takových faktorů je ultrafialové (UV) záření ze slunečního záření.1 Během expozice UV záření se hladiny reaktivních forem kyslíku (ROS) v kůži dramaticky zvyšují, což je známé jako oxidační stres. Několik faktorů environmentální toxicity také zvyšuje oxidační stres na kůži, jako jsou pesticidy, tetrachlormethan, těžké kovy, aromatické aminy a částice 2,5 (PM2,5).2 V biochemickém mechanismu jsou intracelulární oxidanty generovány z ne enzymatický systém, přeměňuje je na ROS, aby spustil cestu melanogeneze.3

Kromě ROS existuje mnoho faktorů, které ovlivňujíprodukci melaninuvčetně genové exprese, zánětu, endokrinních změn a vychytávání pigmentu.1 V prvních krocích produkce melaninu hraje tyrosináza roli při katalýze tyrosinu na fenomelanin a eumelanin. Oba mechanismy výroby pigmentů jsou podobné, což zahrnuje hydroxylaci L-tyrosinu na 3,4-dihydroxy-L-fenylalanin (L-DOPA) a oxidaci L-DOPA na dopachinon. V dalším kroku je dopamin v melanozomu oxidován proteinem příbuzným tyrosináze 1 (TRP-1) a proteinem příbuzným tyrosináze 2 (TRP-2), který je regulován transkripčním faktorem spojeným s mikroftalmií ( MITF) za vzniku melaninu. Nakonec melanin zraje a vysráží se ve stratum corneum.4,5 Ty pronikají do sousedních keratinocytů bazální vrstvy a chrání jejich DNA před jakýmikoli UV-indukovanými mutacemi nebo modifikacemi. Zralý melanin v melanozomech se přenáší do keratinocytů6−9 a nakonec vede k dlouhotrvající pigmentaci. Lentigines, pihy a hnědé/černé skvrny někdy způsobují sociální problémy u mužů a žen. Blokování oxidačního stresu nebo potlačení aktivity tyrosinázy je jednou ze strategií k downregulaci syndromu hyperpigmentace a dermatologických poruch. Antioxidanty léčí hyperpigmentace a poškození buněk způsobené ROS.10,11 Proto mají syntetizované antioxidační sloučeniny mnoho biofunkčních aplikací v aplikacích péče o pleť.

Fulleren (C60), uhlíková nanotrubice (CNT), grafen a grafenový nanoribbon (GNR) jsou čtyři druhy sp2 nanokarbonu široce zkoumané po celém světě.12 Fulleren a jeho deriváty nebo komplexy byly považovány za silnélapače volných radikálůna dlouhou dobu. Yodh a kol. používal ve vodě rozpustný C60 jako ochranný prostředek proti degeneraci vyvolané katabolickým stresem. Inject et al. dospěl k závěru, že C60(OH)24 je silná antioxidační sloučenina, když je oxidační stres příliš vysoký. Okuda a kol. navrhli, že komplexy C60 mohou zabránit poškození buněk zprostředkovanému NO.13,14 Tong et al. ukázaly, že C60komplexy by mohly být slibnými kandidáty pro léčbu nemocí souvisejících s mozkem způsobených zvýšenými hladinami superoxidu. Ve skutečnosti jedna japonská společnost identifikovala fullereny se silnou antioxidační aktivitou pro kosmetické použití v roce 2006. Lucente-Schultz et al. prokázali, že schopnost funkcionalizovaných jednostěnných CNT (SWCNT) pohlcovat kyslíkové radikály je téměř 40krát větší než schopnost dendritických C60.15−19 Fenoglio et al. pozorovali, že vícestěnné CNT (MWCNT) mají pozoruhodnou schopnost zachycovat radikály v kontaktu s externím zdrojem hydroxylových nebo superoxidových radikálů.20 Výpočty hustoty funkční teorie také odhalily model SWCNT jako lapače volných radikálů. V roce 2004 Novoselov a kol. nejprve prokázali, že grafen vykazuje silný ambipolární elektrický efekt a mohl by být slibný pro elektronické aplikace.21 Následně pokračovali v ukazování, že grafen má elektronické vlastnosti, které jsou charakteristické pro 2D plyn částic popsaný Diracovou rovnicí.22,23 Od V těchto dvou průkopnických pracích se stále více pozornosti věnuje výzkumu založenému na grafenu.24−30 Například Qiu et al. v roce 2014 ukázal, že oxid grafenu a několikavrstvý grafen vykazují významnou antioxidační aktivitu a mohou chránit různé biomolekulární molekuly před oxidací.31 Han et al. v roce 2007 experimentálně demonstrováno, že energetickou mezeru GNR lze řídit během litografického procesu změnou šířky pásu.32 Mezi čtyřmi nanokarbony je GNR věnováno nejméně pozornosti. Pokud je nám známo, existuje jen malý výzkum antioxidačních vlastností nanoribbonů grafenového oxidu (GONR).31,33 Proto jsme v této studii pečlivě připravili MWCNT, krátké MWCNT, GONR a krátké GONR a zaměřili jsme se na porovnání jejich antioxidačních vlastností a související výsledky systematicky.

2. VÝSLEDKY A DISKUSE

2.1. Morfologie MWCNT a GONR.

Figure 1a shows the low- and high-magnification transmission electron microscopy (TEM) images of MWCNTs and short MWCNTs. Following acidic cutting under ultrasonication, the length of MWCNTs could be shortened from >10 μm až 2−3 μm. Současně bylo pozorováno, že úprava kyselinou dusičnou zdrsňuje hladké povrchy trubek. Na obrázku s velkým zvětšením jsou zobrazeny některé zářezy a nepravidelné tvary. Dále, použitím MWCNT a krátkých MWCNT prostřednictvím mikrovlnných reakcí se získá GONR a krátký GONR. Také jsme ilustrovali snímky GONR a krátkého GONR s malým a velkým zvětšením TEM. Vzhledem k velkému podélnému rozepínání a menšímu horizontálnímu řezání se zdá, že GONR byly kratší než MWCNT. Na druhou stranu snímky s velkým zvětšením ukázaly větší průměry, tj. 0.11−0,18 μm, GONR než ty MWCNT, což naznačuje, že proces rozbalení byl úspěšný. Podobně krátké GONR vykazovaly kratší délku a větší průměr než krátké MWCNT. Ve vzduchovém kompresoru našeho nového procesu rozepínání byly tenké vrstvené struktury GONR menší než to, co jsme získali v dřívější zprávě pro stejný mikrovlnný výkon 250 W při zachování silnějších centrálních MWCNT.12 To znamenalo jádro-plášť MWCNT Heterostruktura /GONR by se pravděpodobněji objevila namísto plně rozbalené nanopáskové struktury prostřednictvím všech mikrovlnných výkonů v novém procesu. Pro srovnání s krátkým GONR v našich předchozích studiích34, vyšší mikrovlnný výkon generoval více zářezů na straně pásků a nevytvářel pěkné, hladké okraje pásků. Všimněte si, že jsme použili dva různé druhy Cu mřížek na obrázku 1a. Pro MWCNT a GONR s dostatečnou délkou byla použita mřížka Gu s krajkovým formvarem stabilizovaným uhlíkem (produkt č. 01881-F, Ted Pella, Inc., USA). Otevřené otvory v krajkové uhlíkové fólii bránily překrývajícímu se přenosu mezi nanokarbony a uhlíkovou fólií. Tmavě šedé sítě patří do krajkového uhlíkového filmu. Pro krátké MWCNT a krátké GONR však byla potřeba mřížka Gu s formvarem stabilizovaným uhlíkem (produkt č. 01800-F, Ted Pella, Inc., USA). Bylo to proto, že velké díry v krajkové uhlíkové fólii způsobovaly problémy s efektivním držením krátkého MWCNT a krátkého GONR. Jak je znázorněno na obrázku 1, světle šedý kontrast pod krátkými MWCNT a krátkými GONR je lehká vrstva uhlíku. Tato uhlíková vrstva stabilizovala formvarový film vystavený elektronovému paprsku prostřednictvím svých tepelně a elektricky vodivých vlastností.

2.2. Konfigurace spojování MWCNT a GONR.

Ramanova spektra čtyř nanokarbonů jsou uvedena na obrázku 1b; pásmo D u GONR bylo po procesu rozbalení vyšší než u MWCNT. To bylo přičítáno vyšší úrovni oxidace a většímu počtu okrajových struktur GONR ve srovnání s MWCNT. Tento jev je také podobný tomu, co jsme pozorovali v 2011.12 Vzhledem k vysoké úrovni grafitizace měl G pás MWCNT nejnižší číslo v plné šířce v polovině maxima. Poměry ID/IG čtyř nanokarbonů byly {{10}}.076, 0,502, 0,483 a 0,700, v tomto pořadí. Stručně řečeno, snížená délka a povrchová oxidace zvýšily úroveň defektů a tím zvýšily poměry ID/IG. Vrchol D' je přítomen ve všech defektních grafenech a je považován za měřítko kvality.35 Jak je znázorněno na obrázku 1b, vrcholy D' ve čtyřech spektrech se stávají výraznějšími po procesu řezání nebo rozepínání, což naznačuje, že jsou destruktivní. procesy, které přinášejí mnoho defektů. Obrázek 1c,d zobrazuje rentgenová fotoelektronová spektroskopická spektra čtyř nanokarbonů. Zdá se, že vrchol D′ je nejjasnější pro krátké GONR. Jak je znázorněno na obrázku 1c, hladina O významně vzrostla ze 7,6 procenta (MWCNT) na 19,9 procenta (GONR) díky silné oxidační schopnosti KMnO4 v kyselém prostředí. Na druhé straně se hladina O mírně zvýšila o 0,8 procenta z MWCNT na krátké MWCNT. Důležité je, že nejvyšší hladina O je 38,3 procenta pro krátký GONR, což znamená, že na konce nanoribbonů by bylo snazší připojit kyslíkové funkční skupiny než na planární povrchy sp2. Větší číslo plné šířky v polovině maximálního počtu a posun k vysoké vazebné energii píků C1s po procesu rozbalení MWCNT i krátkých MWCNT jsou znázorněny na obrázku 1d. U oxidů grafenu by mohly být dekonvoluované píky na straně s vysokou vazebnou energií přiřazeny vazbám C−C(CC), C−O, CO a COOH.36 Charakterizovali jsme GONR (200 W) v roce 2013 ,37 a výsledky byly podobné výsledkům této studie. Tato studie uzavřela jev Ramanových spekter, což znamená, že během transformace z trubice na stuhu bylo generováno více funkčních skupin obsahujících kyslík (obrázek 2).

2.3. Antioxidační vlastnosti MWCNT a GONR.

2.3.1. Stanovení 1,1-difenyl-2-pikrylhydry- drazylových volných radikálů zachycovací testy aktivity.

1,1- Difenyl-2-pikrylhydrazyl (DPPH) pohlcující volné radikály je antioxidační platforma aplikovaná k detekci antioxidační kapacity; výsledky pro čtyři nanokarbony jsou popsány v tabulce 2. V testu DPPH byl jako pozitivní kontrola použit vitamin C v koncentraci 100 μM. Pro testování antioxidačních aktivit MWCNT, krátkých MWCNT, GONR a krátkých GONR byly do reakčního roztoku inkubovány dávky 1, 5 a 10 mg/l za účelem měření vlastností. MWCNT, krátké MWCNT, GONR a krátké GONR měly střední inhibiční schopnosti při 10 mg/l (19,2 ± 0,3, 12,1 ± 0,3, 26,8 ± 0,3 a 30,0 ± 0,4 procenta), zatímco vitamín C měl podobný stav při 100 μM (93,4 ± 0,1 procenta) pro potlačení.

2.3.2. Test iontové chelatační aktivity.

V situaci oxidativního stresu může ferozin vytvořit komplex s Fe2 plus, který bude kvantitativně měřen. V přítomnosti chelatačních mediátorů se komplex rozbije, což způsobí redukci železnatých iontů z tmavě červené barvy komplexu Fe2 plus. Jako pozitivní kontrolu jsme použili EDTA. Tabulka 2 ukazuje, že MWCNT, krátké MWCNT, GONR a krátké GONR měly chelatační aktivitu při 10 mg/l (29,2 ± {{10}},8, 28,7 ± 0 0,7, 69,7 ± 0,6 a 68,9 ± 0,3 procenta), zatímco pozitivní kontrola měla podobné podmínky při 100 uM (93,4 ± 0,1 procenta).

2.3.3. Měření výkonu antioxidantu snižujícího železo.

Test železitého redukčního potenciálu je jednoduchý a spolehlivý test používaný ke kvantifikaci syntézy komplexu Fe(III)-ferikyanid. V tomto testu byla detekována redukční síla čtyř nanokarbonů produkujících železnatý komplex Fe(III)-TPTZ změnami barvy roztoku ze žluté na zelenou a modrou. Tabulka 2 ukazuje, že redukční síly MWCNT, krátké MWCNT, GONR a krátké GONR byly optické hustoty (OD) 1,11, 1,13, 1,15 a 1,11 při 10 mg/l.

2.3.4. MWCNT a GONR inhibují intracelulární akumulaci ROS.

Mnoho zpráv ukazuje, že ROS ničí strukturální integritu buněčných membrán, včetně buněčných membrán a jaderných membrán, což vede k poškození buněk a ztrátě normální funkce.38−40 Kromě toho je ROS také jedním z důležitých faktorů katalyzujících tvorbu tyrosinázy. melanin a inhibice produkce ROS je dobrou strategií pro downregulaci syntézy melaninu. V této studii jsme použili 2',7'-dichlordihydrofluorescein diacetát (DCFDA) barvicí test k analýze úrovně intracelulárního oxidačního stresu v buňkách léčených MWCNT a GONR. Forbol 12-myristát 13-acetát (PMA) indukoval oxidační stimulaci ve skupinách MWCNT a GONR a byl použit jako negativní kontrola.41 Když byla koncentrace PMA 20 ng/ml, vyvolal oxidační stres, zvyšující hodnota na 38 procent; po léčbě GONR a MWCNT byly hladiny ROS sníženy na normální úroveň. Data ukázala, že oba materiály inhibovaly úrovně oxidačního stresu a antioxidační účinek GONR byl vyšší než u MWCNT (obrázek 3). Tabulka 1 ukazuje podobný seznam následků. Tvrdili jsme, že existují tři důvody pro naše nová zjištění: za prvé, pořadí rozpustnosti těchto materiálů bylo následující: krátké GONR > GONR > krátké MWCNT > MWCNT, což znamená, že kontaktní plocha krátkých GONR byla největší, takže byla vynikající pro čištění ROS. Zadruhé, GONR a MWCNT byly sp2-uhlíkové struktury, které mohly zničit elektřinu ROS tvorbou aduktů nebo přenosem elektronů.42 Zjistili jsme, že antioxidační účinky nanorribbonových struktur byly lepší než u nanotrubicových struktur, takže nanorribbony to dělají snazší přenos elektronů než nanotrubice. Nakonec na obrázku 1b pozorujeme, že uhlíkové místo GONR sp2- obsahovalo více funkčních skupin kyslíku než MWCNT, skupiny karboxylových kyselin mohly chelatovat kovové ionty a hydroxylové skupiny mohly být donorem H k vychytávání ROS a inhibují produkci melaninu.

2.4. Cytotoxicita MWCNT a GONR léčených v buňkách lidských dermálních fibroblastů.

Metoda {{0}}(4,5-dimethylth-iazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromidu (MTT) byla použita k vyhodnocení cytotoxické vlastnosti GONR na buňkách Hs68 (obrázek 3) a buňky byly kultivovány v různých dávkách 1, 5 a 10 ug/ml. Zkoumali jsme, že buněčné životaschopnosti MWCNT byly 100,7 ± 3,7, 99,8 ± 4,9 a 94,1 ± 4,7 procent při koncentracích 1, 5 a 10 mg/l, v daném pořadí; životaschopnost pro krátkou MWCNT byla vypočtena ve stejném pořadí a bylo zjištěno, že je 93,9 ± 2,2, 86,4 ± 3,0 a 98,9 ± 2,1 procenta. Pozorovali jsme, že buňky B16-F10 byly inkubovány ve vysokých koncentracích a přežití buněk Hs68 bylo více než 80 procent, což naznačuje, že MWCNT a krátké MWCNT neměly žádný toxický účinek na buňky lidských dermálních fibroblastů. Životaschopnost buněk GONR a krátkého GONR byla 86,24 ± 2,1, 90,87 ± 3,5, 88,58 ± 2,5, 89,03 ± 3,6, 90,71 ± 2,8 a 90,64 ± 2,5 procenta Na obrázku 4a je také uvedeno, že GONR a krátký GONR neměly rozpoznatelný cytotoxický účinek na buňky HS68. V předchozích zprávách bylo použití netestovaných nanomateriálů pro kosmetické účely považováno za sporné43,44 a bylo to obvykle způsobeno napadením DNA poté, co nanočástice vstoupily do buněk. Po testu cytotoxicity jsme zjistili, že naše materiály nezpůsobují toxicitu pro normální kožní buňky. Došli jsme k závěru, že poté, co nanomateriály vstoupily do buněk, nanomateriály pouze inhibují produkci melaninu snížením oxidačního stresu a chelatací kovových iontů a nepoškozují mitochondrie nebo DNA, což znamená, že použití MWCNT a GONR bylo bezpečné.

2.5. Dva typy MWCNT a GONR v aktivitě B16-F10 buněčné tyrosinázy a obsahu melaninu.

V dráze syntézy melaninu hraje klíčovou roli tyrosináza. Tyrosináza oxiduje a tvoří eumelanin a feomelanin prostřednictvím řady biochemických reakcí. Abychom zjistili, zda GONR a MWCNT inhibují aktivity tyrosinázy a způsobují snížení produkce melaninu, analyzovali jsme aktivitu tyrosinázy v buňkách B16-F10. Zjistili jsme, že MWCNT a krátké MWCNT inhibovaly aktivitu tyrosinázy přibližně o 17,1 procenta a 23 procent při 10 mg/l. GONR a krátké GONR měly lepší účinky při potlačování aktivity tyrosinázy při stejných koncentracích ve srovnání s jiným GONR. Byly také závislé na dávce a inhibovaly 49,8 procent a 44,7 procent tyrosinázové aktivity, jak je znázorněno na obrázku 4b.

Melanin je nepostradatelný pigment v lidském těle, ale nadměrná exprese melaninu často spouští řadu onemocnění. V předchozích studiích Xiao et al. použil podobný materiál, Radical Sponge, fullerenovou nanočástici, jako antimelaninové činidlo.45 Byly zjištěny dobré výsledky; asi 20 procenta produkce melaninu mohla být inhibována. Abychom zlepšili jeho účinnost, dále jsme zlepšili testovací materiál pro měření míry inhibice melaninu a jeho molekulárního mechanismu, jak je znázorněno na obrázcích 4c a 5. MWCNT a krátké MWCNT snížily obsah melaninu o 17,6 ± 5,5 a 13,2 ± {{ 16}},2 procenta při 10 mg/l a způsobem závislým na dávce. GONR a krátké GONR výrazně snížily hodnoty na 32,0 ± 2,3 a 35,3 ± 3,4 procent při 10 mg/l. Experimentální výsledky naznačovaly, že všechny čtyři typy mohly inhibovat syntézu melaninu a GONR měly silnější účinek. Na druhou stranu jsme také pozorovali, že krátký GONR má lepší účinek při inhibici produkce melaninu. Došli jsme k závěru, že krátké GONR mají více funkčních skupin a mohou účinně zabránit tyrosináze katalyzované kovovými ionty, čímž dále inhibují produkci melaninu (obrázek 2). V tabulce 1 jsme pozorovali, že snaha krátkého typu chelatujícího kovové ionty je vyšší než u normálního typu; to znamená, že tyto krátké GONR by mohly být potenciálně použity v kosmetické oblasti jako prostředky pro péči o pleť.

2.6. Mechanismus MWCNT a GONR inhiboval obsah buněčného melaninu B16-F10.

Buňky reagují na vnější oxidační stres regulací exprese proteinu. Buňky B16−F10 zesilují expresi genu c-myc a up-regulovaly AMPK ke snížení oxidačních hladin46 a v této práci je MITF specifickým transkripčním faktorem tyrosinázy k regulaci signální dráhy molekulární syntézy melaninu.47−49 Na obrázku 5a, MWCNT a GONR snižují transkripční faktor spojený s mikroftalmií snížením oxidačního stresu, a poté byly downregulovány také downstream geny TRP-1 a TRP{11}}. U hladiny proteinu byl nalezen podobný jev, kdy MWCNT a GONR downregulovaly dráhu melanogeneze související s MITF a poté nakonec snížily obsah melaninu (obrázek 5b).

3. EXPERIMENTÁLNÍ MATERIÁLY A METODY

3.1. Příprava MWCNT a GONR.

Příslušný proces výroby GONR byl popsán v předchozím článku.12 MWCNT (0.05 g) bylo suspendováno v 9:1 H2SO4/H3PO4 a ošetřeno mikrovlnným reaktorem (CEM-Discover) s výkonem nastaveným na 250 W po dobu 2 min. Po přidání KMn04 (0,25 g) k roztokům byly roztoky ošetřeny stejným mikrovlnným výkonem při 65 stupních po dobu 4 minut12 Tento proces jsme poté upravili použitím kratší doby mikrovlnné trouby druhého stupně 8 minut za použití vzduchového kompresoru. Zde se vzduchový kompresor používá k řízení teploty mikrovlnného reaktoru během procesu. Mikrovlnný výkon byl v předběžných testech nastaven na 250 W.

3.2. Příprava krátkých MWCNT a krátkých GONR.

Relevantní proces pro vytvoření krátkých GONR byl popsán v našem předchozím článku.34 Doba kyselého ošetření byla zvolena na 8 hodin. Mikrovlnný výkon byl nastaven na 250 W, což je stejné jako při získávání GONR.

3.3. DPPH Radical Scavenging Activity.

DPPH se často používal k rozhodování o vychytávací kapacitě vzorků a antioxidačních vlastnostech.50 DPPH je purpurové činidlo, které mění barvu z fialové na žlutou, pokud je volný radikál přenesen do analytu. K roztoku byly přidány pozitivní antioxidační vzorky s vhodnými koncentracemi a vzorky byly analyzovány při 517 nm po dobu 30 minut. Použili jsme procenta zbývajícího DPPH kromě testovacích vzorků k měření množství antioxidantu potřebného ke snížení předchozích radikálů DPPH. Vitamin C v koncentraci 100 μM byl použit jako pozitivní kontrola. Aktivita zachycování (procenta) byla měřena jako

Kapacita čištění ( procenta )=(vzorek − prázdné) / (kontrola − prázdné místo) × 100 procent (1)

3.4. Chelatační činnost kovů.

Kovový iont je faktorem, který způsobuje nadměrnou oxidaci lipidů, a Fe2 plus je jedním z nejvíce ovlivňujících iontů.50 Různé koncentrace nanobiomateriálu (1 μl) byly vloženy do 96-jamkové destičky, která obsahovala 2 mM FeCl2·4H2O (10 ul) a poté naneseny do ferozinu (5 mM, 20 ul). Směs byla plně smíchána s 69 ul mentolu a udržována při teplotě místnosti po dobu 10 minut. Poté byl reakční roztok vzorku pozorován při 562 nm. EDTA byla použita jako pozitivní kontrola při 100 uM a vzorec pro výpočet chelatační aktivity kovů byl založen na ekv.

3.5. Snížení výkonu.

Výpočet redukční síly je založen na předchozí studii.50 Nejprve bylo 2,5 μl grafenových materiálů smícháno s PBS pufrem (67 mM, pH 6,8) a K3Fe(CN)6 (2,5 μl, 20 procent) a poté inkubováno při 50 stupních po dobu 20 min. Poté byla 10% kyselina trichloroctová (160 ul) smíchána s činidly při 300 g centrifugována po dobu 20 minut. Absorpční délka byla stanovena při 700 nm po smíchání s 25 ul FeCl3 (2 procenta). Butylovaný hydroxyanisol (BHA) byl použit v koncentraci 100 uM.

3.6. Vyšetření buněčné proliferace.

K analýze poměru buněčné proliferace byla použita buněčná linie lidských dermálních fibroblastů HS68. HS68 byla inkubována v Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu (DMEM) obsahujícím 10 procent fetálního hovězího séra a 1 procento smíšeného penicilinu a streptomycinu.50,51 Po ošetření různými koncentracemi vzorků jsme aplikovali MTT k detekci poměru buněčné proliferace. 8000 buněk bylo nasazeno do 96-jamkových destiček a ošetřeno vzorky po dobu 24 hodin. Roztok supernatantu byl odstraněn a my jsme použili MTT roztok ke kultivaci po dobu 2 hodin při 37 stupních. Po inkubaci jsme odstranili médium obsahující MTT a rozpustili je dimethylsulfoxidem (DMSO). Roztok byl odečítán při OD 590 nm a rychlost vypočtena podle ekv. 1.

3.7. Stanovení obsahu buněčného melaninu.

Použili jsme metodu s drobnými modifikacemi založenou na předchozím testu.52,53 Buněčné pelety B16−F10 z Bioresource Collection and Research Center (BCRC, CRL 6323, Hsinchu, Taiwan) byly rozpuštěny ve směsi 2,0 N NaOH a 10 procent DMSO. Vzorek byl následně zahříván po dobu 1 hodiny na 90 stupňů a centrifugován při 10,000g po dobu dalších 10 minut, aby se získal vyčeřený supernatant. Počet melaninu byl stanoven monitorováním OD supernatantu při 475 nm.

3.8. B16-F10 Aktivita buněčné tyrosinázy.

Pro aktivitu B16-F10 buněčné tyrosinázy jsme odkazovali na předchozí práci s některými modifikacemi.50 Buňky byly kultivovány v 12-jamkových destičkách po 105 buňkách v každé jamce. Po ošetření vzorky byly buňky lyžovány v 1% Triton X-100/PBS a 2 mM L-tyrosinu (50 ul) po dobu 3 hodin. Po inkubaci jsme médium odstranili a odečetli jsme absorbanci při OD 590 nm. Vzorec aktivity tyrosinázy byl vypočten podle ekv 1.

Cistanche je inhibitor tyrosinázy.

3.9. Detekce ROS pomocí DCFDA barvení.

S odkazem na předchozí studii,54 1.2 1.105 B16−F10 buňky byly nasazeny do 6-jamkových destiček a ošetřeny různými koncentracemi vzorků. Buňky byly suspendovány v PBS a poté naplněny DCFDA (5 uM) v DMEM bez fenolové červeně po dobu 30 minut při 37 °C. Průtokový cytometr (Guava, Merck, Německo) byl použit k detekci fluorescenčního signálu DCFDA. Excitační a emisní vlnové délky DCFDA byly 488 a 535 nm.

3.10. Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase.

Postupovali jsme podle metod Lin et al. (2018).1 Kvantitativní reverzní transkripce-polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qRT-PCR) sestávala z exkluzivní primerové sondy pro generování fluorescence. Použila techniku ​​fluorescenční detekce, která snímá každý cyklus pomocí systému 7500 qRT-PCR (Applied Biosystems, USA). Detekoval cyklus na základě množství uvolněné fluorescence a poté byl pro generovaný obsah vypočten produkt každého cyklu, což vedlo k dosažení kvantitativních účelů v reálném čase. Trizol (Invitrogen, USA) byl použit k extrakci kompletní RNA plicní tkáně podle pokynů výrobce. Následně byla pro vytvoření DNA použita souprava pro reverzní transkripci (Takara, Japonsko). V qRT-PCR s použitím primerů, uvedených v tabulce 1, byl vzorek nejprve zahřátý, aby se vytvořil jeden řetězec DNA; poté došlo k navázání primeru za vzniku dvouvláknové DNA (dsDNA), načež byla zkombinována SYBR Green dsDNA, k čemuž byla použita reagenční souprava SYBR green plus (Roche, Basel, Švýcarsko), což vedlo k uvolnění fluorescence. Výsledný produkt prošel fluorescenčním detekčním systémem. Detekce fluorescenčních signálů probíhala během fáze prodlužování nebo žíhání každého cyklu; po detekci byl obsah vzorku zpětně tlačen detekovanými intenzitami fluorescence.55 Hladiny exprese cílových genů byly normalizovány na hladiny -tubulinu pomocí metody 2−ΔACt.

myricetin

3.11. Western Blot test.

Buňky B16-F10 byly lyžovány při 4 stupních přes noc radioimunoprecipitačním testovacím pufrem (Thermo Scientific Co., USA), který obsahuje inhibitory proteázy. Ke kvantifikaci množství proteinu byla použita souprava pro stanovení proteinu kyseliny bicinchoninové (BCA, Sigma-Aldrich Corp., USA). Vzorkové proteiny byly separovány na 10% dodecylsulfát-polyakrylamidovém gelu sodném a přeneseny na polyvinylidendifluoridovou (PVDF) membránu (PALL Life Science, Ann Arbor, MI, USA). PVDF membrána byla blokována blokovacím pufrem (Thermo Scientific) po dobu 1 hodiny a inkubována se specifickou primární protilátkou přes noc při 4 stupních. Dále byla membrána dvakrát promyta Tris pufrovaným fyziologickým roztokem-Tween 20 pufrem a inkubována se sekundárními protilátkami po dobu 1,5 hodiny. Poté byla membrána ponořena do chemiluminiscenčních detekčních činidel (Thermo Scientific) a analyzována pomocí MiniChemi Chemiluminescence imager (Beijing Sage Creation Science, Čína). Zdroje protilátek zahrnovaly králičí anti-MITF, králičí anti-TRP-1, králičí anti-TRP-2 a -aktin (Thermo Scientific).

3.12. Materiálová analýza.

K pozorování morfologie nanokarbonů byl použit TEM (JEOL JEM{0}}, 100 kV). Pro kontrolu rezonančních režimů nanouhlíků byl použit mikro Ramanův spektrometr (PTT, RAMaker). Pro stanovení kompoziční analýzy byla také provedena měření rentgenovou fotoelektronovou spektroskopií (XPS, Kratos Axis Ultra DLD).12,34

3.13. Statistická analýza.

Všechny vzorky a standardní experimenty byly opakovány alespoň třikrát. Ke statistickému srovnání a vyjádření průměru středních hodnot ± směrodatná odchylka jsme použili Studentův t-test.

4. ZÁVĚR

Abychom to shrnuli, pozorovali jsme, že krátký GONR byl potenciálním materiálem pro produkty péče o pleť díky svým mnohočetným biofunkčním vlastnostem (obrázek 6). Výsledky ukázaly, že nanokarbony hrály roli jako extracelulární a intracelulární antioxidant. Mezitím nanokarbon inhiboval aktivitu tyrosinázy a obsah melaninu a nezpůsobil žádné vážné poškození pigmentových buněk. Tato práce stanovila antimelanogenezní funkce čtyř typů nanokarbonů; budoucí studie budou zkoumat mechanismus těchto sloučenin na expresi specifických genů a proteinů souvisejících se zráním, transportem a akumulací melaninu.

Cistanche zlepšuje bělení.

Klikněte prosím na obrázek a získejte další podrobnosti.