Antioxidační, protizánětlivý a proti stárnutí potenciál extraktu Kalmia Angustifolia a identifikace některých hlavních sloučenin Část 1
May 25, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
Abstraktní:Stárnutí kůže je nejviditelnějším prvkem procesu stárnutí, který vyvolává u mnoha lidí velké obavy. Rostliny z čeledi Ericaceae mají obecně antioxidační a protizánětlivé vlastnosti, což z nich činí potenciální aktivní složky proti stárnutí. Cílem této studie bylo vyhodnotit bezpečnost a účinnost proti stárnutí extraktu Kalmia angustifolia pomocí rekonstruovaných kožních náhrad. Hodnocení bezpečnosti bylo provedeno pomocí testu 3-(4,{5}}dimethylthiazolyl-2)-2,5-difenyltetrazoliumbromidu (MTT), přičemž účinnost byla stanovena hodnocením antioxidační a protizánětlivé aktivity a analýzou kožních náhražek rekonstruovaných podle metody sebeskládání histologickým a imunofluorescenčním barvením (elastin, kolagen-1, kolagen-3, aquaporin-3) . Test viability buněk stanovil bezpečnost extraktu v koncentraci až 200 ug/ml. Test Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) a buněčný test s použitím 2',7'-dichlorfluorescein-diacetátu (DCFH-DA) odhalily silnou antioxidační aktivitu s hodnotou ORAC 16 μmol ekvivalentu Troloxu/mg a půl- maximální inhibiční koncentrace (IC50) 0,37 ± 0,02 ug/ml, zatímco zajímavá protizánětlivá aktivita byla nalezena v inhibici produkce NO, s procentem inhibice produkce NO 49 ± 2 procenta při 80 ug/ml. Izolace a charakterizace extraktu umožnila identifikaci sloučenin, které by mohly být zodpovědné za tyto biologické aktivity, přičemž dvě z nich byly identifikovány poprvé v K.cistanche stonekAngustifolia: avicularia a epikatechin-(2 -O-7, 4 -6)-ent-epikatechin. Histologické analýzy kožních náhrad ošetřených extraktem prokázaly nárůst tloušťky kůže ve srovnání s kontrolami. Extrakt z K. Angustifolia zvýšil expresi elastinu a kolagenu-1, které se obvykle snižují se stárnutím pokožky. Tyto výsledky naznačují, že K. Angustifolia má slibnou antioxidační účinnost a potenciál proti stárnutí.
Klíčová slova: kožní náhražky; stárnutí kůže; přírodní produkty; účinné látky; Ovčí vavřín; antioxidační aktivita; protizánětlivá aktivita; tkáňové inženýrství
1. Úvod
Stárnutí kůže je přirozený fyziologický proces, který znepokojuje mnoho lidí. Jedná se o první "viditelnou známku postupujícího věku a degenerace pokožky. Proto formulace anti-aging: kosmetické přípravky nabyly v posledních letech na důležitosti kvůli touze omezit tento projev stárnutí. Stárnutí pleti je charakterizováno mnohočetné změny na biologické úrovni, které zahrnují snížení buněčné proliferace vedoucí k epidermální atrofii a snížení dermálních složek, jako jsou fibroblasty a elastinová a kolagenová vlákna, a tím snížení tloušťky kůže u starších dospělých [1,2] Boreální les je plný neprobádaných zdrojů s velkým potenciálem pro vývoj kosmetických účinných látek Kalmia angustifolia, také známá jako Sheep Laurel, je krytosemenná rostlina z čeledi Ericaceae.výhody a vedlejší účinky cistanche tubulosaTato rostlina pochází z východní Severní Ameriky, ale vyskytuje se hlavně v kanadském boreálním lese [3]. V tradiční indiánské medicíně se K. Angustifolia používala k léčbě různých zdravotních problémů zahrnujících záněty, jako jsou bolesti žaludku, vymknutí a otoky, což naznačuje, že tato rostlina má protizánětlivé vlastnosti [4]. Různé rostliny z čeledi Ericaceae mají také protizánětlivé a antioxidační vlastnosti, které z nich činí zajímavé kosmetické aktivní složky. Chemické složení K.angustifolia není dosud dobře zdokumentováno. Některé studie identifikovaly toxické sloučeniny, jako jsou grayanotoxiny, což jsou neurotoxiny jedovaté pro člověka při požití, ale zřídka smrtelné, a arbutin (4-hydroxyfenyl-D-glukopyranosid), inhibitor tyrosinázy nalezený v listech K. Angustifolia a používá se jako depigmentační činidlo [5-8]. Navzdory těmto potenciálně toxickým sloučeninám nalezeným v K. Angustifolia další výzkum také prokázal, že flavonoidy, fenolové kyseliny, taniny a terpeny lze v rostlině nalézt v hojnosti [9-15]. Některé z těchto sloučenin mají zajímavé biologické aktivity a mohly by proto poskytnout K. Angustifolia slibný účinek proti stárnutí, jako tomu je u jiných rostlin.
Cistanche může proti stárnutí
I když je potřeba vyvinout nové dermokosmetické produkty, které pomáhají předcházet stárnutí pleti, nové zákony zakazující nebo omezující testování na zvířatech v kosmetickém průmyslu to ztěžují. Proto jsou zapotřebí další možnosti testování účinnosti produktu. Použití in vitro buněčných kultur nebo kožních náhražek je dobrou alternativou pro screening kosmetických přísad. Několik modelů je schváleno Evropským centrem pro validaci alternativních metod (ECVAM, Ispra, Itálie) a komerčně prodávány kosmetickým společnostem, aby mohly provádět testy bezpečnosti a vyhnout se zbytečnému utrpení spojenému s používáním zvířat [16,17]. . Většina komerčně dostupných modelů však představuje pouze diferencovanou epidermis a postrádá interakci mezi keratinocyty a fibroblasty [16]. V posledních několika letech se objevily nové modely plné tloušťky a umožnily mimo jiné zkoumání drah stárnutí a sloučenin proti stárnutí, což z nich činí užitečné nástroje pro nahrazení použití zvířat v kosmetické oblasti [18,19].extrakt z cistanche tubulosaCílem této studie bylo nejprve zhodnotit biologickou aktivitu extraktu K. Angustifolia na kultivovaných buněčných monovrstvách a poté vyhodnotit anti-aging potenciál tohoto extraktu pomocí kožních náhrad rekonstruovaných podle metody self-assembly [20,21]. . Síla tohoto modelu náhrady kůže spočívá v tom, že neobsahuje exogenní materiály a spoléhá se na schopnost kyseliny askorbové podporovat produkci extracelulární matrice dermálními fibroblasty, díky čemuž je model zcela lidský.recenze cistanche tubulosaTato studie představuje novou aktivní složku, která by mohla být použita v dermokosmetických produktech, a navrhuje použití in vitro modelů jako alternativy v kosmetickém výzkumu.
2. Materiály a metody
2.1. Příprava rostlinného materiálu a extraktu
K.angustifolia byla sklizena 2. května015 v oblasti Lac-St-Jean v Quebecu v Kanadě. Rostlina byla identifikována M. Patrickem Nadeauem a dokladový exemplář (č. QFA0617265) byl uložen v herbáři Louis Marie z Laval University, Ouébec, Kanada. Nadzemní části K. angustifolia (2,1 kg) byly rozemlety pomocí Fritsch Pulverisette 25 Cutting Mill (Fritsch, Laval, QC, Kanada) a byly extrahovány pod zpětným chladičem bezvodým ethanolem (1,5 l, třikrát) a EtOH-H203:1 ( 1,5 l, dvakrát). Extrakty získané po prvních extrakcích (v EtOH a EtOH-H, O) byly zfiltrovány a spojeny dohromady. Po odpaření EtOH ve vakuu byla vodná fáze rozdělena mezi dichlormethan (DCM, CHCI; 300 ml, pětkrát) a ethylacetát (EtOAc; 300 ml, pětkrát). EtOAc fáze byla odpařena za sníženého tlaku do sucha, čímž byl získán extrakt K. angustifolia (222,6 g, 10,6 procent). Den před ošetřením byl extrakt v práškové formě rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (DMSO; Sigma, Oakville, ON, Kanada), aby se získal zásobní roztok, a poté byl skladován při -20 stupni, dokud nebyl potřeba. Požadované koncentrace K. angustifolia byly získány zředěním zásobního roztoku (12,5 nebo 25 mg/ml) přímo v kultivačním médiu v den experimentu. Konečná koncentrace DMSO byla 0,2 procenta (ofo), aby se zabránilo toxicitě rozpouštědla.
2.2. Izolace hlavních sloučenin extraktu K. Angustifolia
Z výše popsaného EtOAc extraktu byly 30 g separovány chromatografií přes Diaioncolumn (Mitsubishi Chemicals, Charlotte, NC, USA), s použitím MeOH/H2O jako eluentu v gradientových podmínkách (40 procenta , 50 procent , 60 procent , 70 procent a 100 procent ), čímž se získají čtyři obohacené frakce (AD). Frakce B (2 g) byla podrobena sloupci silikagelu (200 g) a eluována gradientem MeOH-DCM od 5 procent do 15 procent, čímž byly získány čtyři frakce (B1-B4). Frakce C (6 g) byla také podrobena koloně silikagelu (300 g) a eluována gradientem MeOH-DCM od 5 procent do 25 procent, čímž bylo získáno sedm frakcí (C1-C7). Frakce C3 (500 mg) byla přečištěna chromatografií na reverzní fázi na koloně C18 (120 g, FLH-R33230B-IS120 SiliaSepTM C18, Silicycle, Quebec, QC, Kanada) za použití 0,1% kyseliny mravenčí v H,O-MeOH z 40 procent až 60 procent. Byly získány čtyři podfrakce: C3A-C3D s C3B a C3C s vysokou čistotou, obsahující hlavní sloučeniny. Frakce C4(2g) byla také purifikována chromatografií na reverzní fázi na C18 koloně za použití 0,1% kyseliny mravenčí v H20-MeOH od 30 procent do 45 procent. Ze separace byly získány tři podfrakce: C4A-C4C, s C4A a C4C vysoké čistoty, přičemž každá obsahovala jednu sloučeninu. Frakce D (8,7 g) byla podrobena silikagelové koloně (2 x 200 g) a eluována gradientovými podmínkami CHCl3-MeOH (15:1;10:1;5:1) za získání osmi frakcí (D 1-D8). Frakce Dl až D4 každá představovala hlavní sloučeninu.
2.3. Analýza NMR a GC-MS
Spektra nukleární magnetické rezonance (NMR) byla zaznamenána spektrometrem Bruker Avance 400 (Bruker, Milton, ON, Kanada) při 400 MHz pro jádra 'H a 100 MHz pro jádra 13C, za použití deuterovaného chloroformu (CDCI3) nebo deuterovaného methanolu (CH3OD) jako rozpouštědlo. Chemické posuny jsou uvedeny v ppm vzhledem k píku zbytkového rozpouštědla. Hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením (HRMS) byla zaznamenána na hmotnostním spektrometru Agilent 6224 MS-TOF (Agilent, Saint-Laurent, QC, Kanada) vybaveném zdrojem elektrospreje.
2.4. Biopsie a extrakce buněk
Primární keratinocyty a fibroblasty byly získány z biopsií operací zmenšení prsou. Dárkyněmi byly kavkazské ženy ve věku od 18 do 52 let. Keratinocyty a fibroblasty byly z biopsií extrahovány dříve popsanou izolační metodou [22,23]. Biopsie byly inkubovány v termolyzinu při 4 stupních po dobu 16 hodin, aby se oddělila epidermis od dermis. Následně byly keratinocyty izolovány z epidermis pomocí trypsinu po dobu 30 minut, zatímco fibroblasty byly izolovány z dermis pomocí kolagenázy po dobu 4 hodin. Buňky byly poté kultivovány do požadované pasáže. Keratinocyty byly použity v pasáži 1 a fibroblasty v pasáži 4.
2.5. Buněčná kultura
Primární fibroblasty (pasáž 4) byly nasazeny v množství 4× 103 buněk/cm² a kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu (DMEM) doplněném 10 procentem FB Essence séra (FBI; Seradigm, Salt Lake City , UT, USA), 100 UI/ml penicilinu G (Sigma, Oakville, ON, Kanada) a 25 ug/ml gentamicinu （Gemini, West Sacramento, CA, USA）. Primární keratinocyty (pasáž 1) byly naočkovány v množství 4 × 103 buněk/cm² na živnou vrstvu ozářených myších fibroblastů 3T3 a kultivovány v kombinaci DMEM s Hamovým F12 v poměru 3:1 (DMEMH), doplněné 5 procenty fetálního klonu Ⅱ sérum (Hyclone, Scarborough, ON, Kanada）, 5 ug/ml inzulínu (Sigma, St. Louis, MO, USA）, 0,4 ug/ml hydrokortizon（Galen-ova, Saint-Hyacinthe, QC, Kanada), 0,212 ug /ml isoproterenol hydrochlorid (Sandoz Kanada, Boucherville, QC, Kanada), 10 ng/ml lidský epidermální růstový faktor (EGF; Austral Biological, San Ramon, CA, USA), 100 UI/ml penicilin G (Sigma, Oakville, ON, Kanada ) a 25 ug/ml gentamicinu (Gemini, West Sacramento, CA, USA). Buněčné kultury byly inkubovány při 37 °C v atmosféře 8 procent oxidu uhličitého (CO2). Buněčné kultivační médium bylo měněno každé dva dny, celkem třikrát týdně.
2.6. Test cytotoxicity
Toxicita extraktu K.angustifolia byla hodnocena na primárních keratinocytech pomocí {{0}}(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,{{5} } test difenyltetrazolium bromidu (MTT). Test MTT je kolorimetrický test založený na enzymatické redukci žluté tetrazoliové soli (MTT) na fialové krystaly formazanu. Tato enzymatická reakce je katalyzována mitochondriální sukcinátdehydrogenázou v metabolicky aktivních buňkách. Používá se tedy k hodnocení životaschopnosti buněk na základě buněčné metabolické aktivity. Stručně, v den 0 byly keratinocyty v P3 od zdravých dárců naneseny v množství 5x103 buněk/jamku na 96-jamkovou destičku na živnou vrstvu ozářených myších fibroblastů 3T3. V den 2 byla přidána léčba. V den 4 bylo na destičku přidáno barvivo MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, Sigma, St. Louis, MO, USA) v koncentraci 0,5 mg/ml ve sterilním fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS)1X. Destička byla poté inkubována po dobu 3 hodin (37 stupňů, 8 procent CO) a formazan byl extrahován čerstvým roztokem isopropanolu a kyseliny chlorovodíkové (HCl). Absorbance byla odečtena při 570 nm pomocí čtečky mikrodestiček (SpectraMax Plus 384 Microplate Reader, Molecular Devices, San José, CA, USA). 2.7. Test kyslíkové radikálové absorpční kapacity (ORAC).
Aby se vyhodnotily antioxidační vlastnosti extraktu K. angustifolia, byl proveden test kyslíkové radikálové absorpční kapacity (ORAC), jak je popsáno v Ou et al. s některými úpravami [24]. Stručně, test byl proveden v 384-jamkové destičce na čtečce destiček Fluoroskan Ascent FLTM (Labsystems, Milford, MA, USA). Byly připraveny různé koncentrace kyseliny Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylové kyseliny; analog vitaminu E), aby se vytvořila standardní křivka v pořadí pro porovnání testovacích vzorků s touto pozitivní kontrolou. Experiment byl proveden při teplotě 37,5 stupně a půl 7,4 s paralelním slepým vzorkem.cistanche UKFluorescence fluoresceinu byla zaznamenávána každých 60 s fluorometrem po přidání 2,2'-azobis(2-amidino-propan) dihydrochloridu. Fluorescence byla měřena při excitační vlnové délce 485 nm a emisní vlnové délce 538 nm. Výsledky byly vypočteny s použitím rozdílů mezi plochami pod rozpadem fluoresceinu ze slepého pokusu a křivky vzorku. Výsledky pro hodnoty ORAC byly vyjádřeny v mikromolech ekvivalentu Troloxu (TE) na miligram (μmol TE/mg) nebo mikromolech TE na mikromol (umol TE/mol).
2.8. Antioxidační aktivita hodnocena pomocí testu na bázi buněk
Antioxidační aktivita byla hodnocena buněčným testem s použitím 2',7/-dichlorfluorescein-diacetátu (DCFH-DA), jak popsal Girard-Lalancette et al. s některými modifikacemi [25]. Stručně řečeno, fibroblasty lidské kůže WS1 (ATCC⑧ CRL-1502, Manassas, VA, USA) byly inkubovány po dobu 60 minut se 100 μl 5μM DCFH-DA v Hanksově vyváženém solném roztoku (HBSS, HyClone, Marlborough, MA, USA) . Poté, aby se vyhodnotila antioxidační aktivita extraktu, byly buňky inkubovány po dobu 60 minut se zvyšujícími se koncentracemi extraktu K. angustifolia a pozitivními kontrolami (quercetin a Trolox). Pro oxidační stres bylo přidáno 100 μl 400 μM tercbutylhydroperoxidu (t-BuOOH) k získání konečné koncentrace 200 μM t-BuOOH v jamkách. Fluorescence byla poté změřena okamžitě a po 90 minutách pomocí automatické čtečky destiček Fluoroskan Ascent FLTM (Labsystems, Milford, MA, USA). Fluorescence byla hodnocena při excitační vlnové délce 485 nm a emisní vlnové délce 538 nm. Antioxidační aktivita byla vyjádřena jako procento inhibice oxidace DCFH.
2.9. Protizánětlivá aktivita hodnocená kvantifikací dusitanů
Protizánětlivá aktivita byla hodnocena hodnocením inhibice produkce oxidu dusnatého (NO) extraktem K. angustifolia, jak je popsáno v Legault et al. [26]. Stručně řečeno, myší makrofágy RAW 264.7 (ATCC⑧ TIB-71, Manassas, VA, USA) byly inkubovány se zvyšujícími se koncentracemi extraktu K. Angustifolia a poté stimulovány 100 ng/ml lipopolysacharidu (LPS). Pozitivní kontrola, hydrochlorid methylesteru Nw-nitro-L-argininu (L-NAME), byla také použita ve dvou různých koncentracích -250 μM (67 ug/ml) a 1 mM (270 ug/ml). Bezbuněčné supernatanty byly shromážděny 24 hodin po LPS stimulaci a koncentrace NO byla okamžitě vyhodnocena pomocí Griessovy reakce. Absorbance byla odečtena při 540 nm za použití Multiskan plate reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Přítomnost dusitanů byla kvantifikována pomocí standardní křivky NaNO. Inaktivované buňky (exponované samotnému médiu) byly použity jako negativní kontrola a aktivované buňky jako pozitivní kontrola.
2.10. Výroba náhražek kůže
Zdravé kožní náhražky byly vyrobeny metodou self-assembly, částečně modifikované pomocí 6-jamkových destiček [20,21]. Stručně, fibroblasty v P5 od zdravých dárců byly nasazeny v množství 1,5 x 105 buněk/jamka a kultivovány po dobu 26 dnů v DMEM doplněném 50 ug/ml (plus)-L-askorbátu sodného (Sigma, St. Louis, MO, USA). dokud nevytvořily manipulovatelné listy. Poté byly dvě fibroblastové vrstvy odděleny a navrstveny, aby se vytvořil dermální ekvivalent. Dermální ekvivalenty byly inkubovány při 37 stupních v atmosféře s 8 procenty CO po dobu dalších dvou dnů, aby se umožnilo splynutí vrstvy a vytvoření nové dermální vrstvy kožních náhrad. Po tomto období byly keratinocyty na P2 od zdravých dárců naočkovány na dermální ekvivalent v množství 1 × 10 stupňů buněk/ekvivalent, aby se vytvořila epidermální vrstva kožních náhrad a kultivovány po dobu sedmi dnů v DMEMH doplněném 50 ug/ml ( plus ) -L-askorbát sodný (Sigma, St. Louis, MO, USA) pro umožnění proliferace keratinocytů. Poté byly kožní náhražky zvednuty na rozhraní vzduch-kapalina, aby se podpořila diferenciace buněk. Na rozhraní vzduch-kapalina byly kožní náhrady kultivovány s médiem postrádajícím EGF, aby se získal stratifikovaný epitel reprezentující kůži in vivo. Čtrnáct dní po zvednutí na rozhraní vzduch-kapalina byly kožní náhrady ošetřeny třikrát týdně po dobu jednoho týdne zásobním roztokem extraktu zředěným v kultivačním médiu (s konečnou koncentrací extraktu K. Angustifolia 25 ug/ml）). Po celkem 56 dnech kultivace byly odebrány biopsie kožní náhrady a analyzovány histologicky a imunofluorescenčním barvením.
2.11. Histologické analýzy
Biopsie kožní náhrady z každého stavu byly fixovány v roztoku HistoChoice （Amresco, Solon, OH, USA） a zality do parafínového vosku. Řezy o tloušťce 5 μm byly poté nařezány a obarveny Massonovým trichromem pomocí barviv Weigertův hematoxylin, fuchsin-ponceau a anilinová modř. Tloušťka dermis a živé epidermis byla měřena pomocí softwaru ImageJ (National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA). Pro měření tloušťky byly analyzovány tři různé buněčné populace a pro každou z nich byly pořízeny dva reprezentativní snímky na stav a bylo provedeno 10 měření na snímek, celkem 60 měření na stav.
2.12. Imunofluorescenční barvení
Biopsie kožní náhrady z každého stavu byly vloženy do Tissue-Tek OCT Compound (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA), zmrazeny v tekutém dusíku a poté udržovány při -80 stupni, dokud nebyly potřeba. Zmrazené řezy normální lidské kůže byly použity jako pozitivní kontroly. Nepřímé imunofluorescenční barvení bylo provedeno na 6 um tlustých kryořezech fixovaných v acetonu. Primární použité protilátky byly: králičí polyklonální anti-elastin (gG) (ředění 1:800, Abcam, Cambridge, MA, USA), králičí polyklonální anti-kolagen-1 (IgG) (ředění 1:300, Cedarlane, Burlington, ON, Kanada),králičí polyklonální anti-kolagen-3 (IgG) (ředění 1:200, Cedarlane, Burlington, ON, Kanada) a králičí polyklonální anti-aquaporin-3(IgG) (ředění 1:500, Abcam, Cambridge, MA, USA). Použitá sekundární protilátka byla oslí anti-králičí IgG (H plus L) Alexa 488 (ředění 1:1600, Life Technologies, Eugene, OR, USA). Buněčná jádra byla po sekundární protilátce označena montážním médiem DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA). Pro semikvantifikaci intenzity fluorescence každého proteinu byla měřena pixelová intenzita imunofluorescenčního barvení pomocí softwaru ImageJ (National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA). Stručně řečeno, celá vrstva kůže (dermis nebo živá epidermis) studovaného proteinu byla analyzována měřením průměrné hodnoty šedé každé oblasti. Intenzita fluorescence ošetřených kožních náhrad byla porovnána s intenzitou fluorescence kontrolních kožních náhrad, aby se vyhodnotila změna v expresi proteinu pozorovaná při ošetření.
2.13. Statistická analýza
Výsledky byly vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka. Statistická analýza testu MTI, testu založeného na antioxidačních buňkách a protizánětlivé aktivity byla provedena jednosměrnou analýzou rozptylu (ANOVA), po níž následoval Dunnettův post hoc test (p-hodnota<0.05 compared="" to="" control="" at="" 0="" μg/ml）="" or="" a="" bonferroni's="" post="" hoc="" test=""><0.05 compared="" to="" controls).="" thickness="" measurements="" were="" analyzed="" with="" a="" t-test.="" results="" were="" considered="" significant="" when=""><0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" with="" r="" software="" (v3.5.2,="" rcmdr="" v2.5-1,="" r-core="" team="" 2018,="" r="" foundation,="" vienna,="">
Tento článek je extrahován z Antioxidants 2021, 10, 1373. https://doi.org/10.3390/antiox10091373 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants