Antioxidační a antimelanogenní účinky tepelně upraveného extraktu z lékořice (Wongam, Glycyrrhiza Glabra × G. Uralensis)
Mar 26, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Min Hye Kang 1,2, Gwi Yeong Jang 1, Yun-Jeong Ji 1, Jeong Hoon Lee 1, Su Ji Choi 1, Tae Kyung Hyun 2,* a Hyung Don Kim 1,*
Abstraktní:Melanin je hnědý nebo černý pigment, který chrání pokožku před ultrafialovým zářením a reaktivními formami kyslíku (ROS). Nadprodukce melaninu je však spojena s lentiginy, melasmatem, pihami a rakovinou kůže.Lékořiceukázalantioxidant, protinádorové, protidestičkové, protizánětlivé a imunomodulační aktivity a používá se jako přírodní léčba kůžebělení.Naším cílem bylo potvrdit potenciál Wongamu, nového kultivaru lékořice vyvinutého RuralDevelopment Administration (RDA), jakoběleníagent v kosmetice. Dále jsme porovnáním ověřili vliv tepelné úpravy na bioaktivitu lékořiceantioxidantaanti-melanogenníaktivity extraktu z lékořice před a po zahřátí (130 ◦C). Tepelně upravený extrakt z lékořice (WH-130) prokázal vyšší aktivity pohlcující radikály v ABTS plus (2,20-azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonová kyselina) diamonná sůl) a testy DPPH (2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl). Kromě toho WH-130 inhiboval melanogenezi účinněji díky downregulaci tyrosinázy v buňkách melanomu B16F10 než nezahřívanélékořicevýpis. Kromě toho tepelné zpracování zvýšilo celkový obsah fenolů. Zejména isoliquiritigenin, anantioxidantaanti-melanogennísloučenina lékořice, byla vyrobena tepelným zpracováním. Závěrem lze říci, že WH-130 se zvýšenými hladinami bioaktivních fenolických látek, jako je isoliquiritigenin, má potenciál pro vývoj v novou pleťbělenímateriál s aplikacemi v kosmetice.
klíčová slova: anti-melanogenníaktivita; tepelné zpracování;lékořice; buňky myšího melanomu (B16F10)
1. Úvod
Lékořice(Glycyrrhiza species), vytrvalá bylina s léčebným využitím z čeledi Leguminosae, je široce rozšířena ve střední Asii, Číně, Rusku, Mandžusku, Mongolsku a Evropě [1]. Již dlouho se používá jako ochucovadlo a sladidlo. Sušený kořen a stolon lékořice se používají k léčbě nachlazení, kašle, astmatu, únavy a infekcí dýchacích cest v důsledku biologických aktivit lékořice, včetněantioxidant,antimikrobiální, protinádorové, protidestičkové, protizánětlivé a imunomodulační aktivity [2,3]. Rod Glycyrrhiza se skládá z asi 22 druhů lékořice, včetně G. uralensisFisch, G. glabra L. a G. inflata Batal.
Wongam, nový mezidruhový hybridní kultivar lékořice, byl vyvinut úřadem RuralDevelopment Administration jako hybrid Glycyrrhiza glabra x G. uralensis (G. korshinskiGrig). Wongam má vyšší výnosy a lepší odolnost vůči chorobám než G. uralensis. Bylo provedeno mnoho studií o biologických aktivitách G. uralensis, zatímco stávající výzkum Wongamu, nového kultivaru, je omezen na jeho antialergické, imunomodulační a protivředové aktivity [1,2]. Je tedy nutné prozkoumat širokou biologickou aktivitu Wongamu.
Hlavní bioaktivní složky vlékořicekořenem jsou flavonoidy a triterpenové saponiny, včetně liquiritinu, liquiritigeninu, isoliquiritigeninu (ISL) a glycyrrhizinu (nebo glycyrrhizicacid) [4,5]. ISL je flavonoid nalezený v lékořici, který vykazuje různé farmaceutické aktivity, včetně protidestičkových, antialergických, protinádorových, protizánětlivých aantioxidantčinnosti [6–8]. ISL je produkt hydrolýzy z isoliquiritinu v kořeni lékořice. Může inhibovat melanogenezi prostřednictvím degradace transkripčního faktoru spojeného s mikroftalmií (MITF) aktivací signální dráhy proteinkinázy regulované extracelulárním signálem (ERK). V důsledku toho degradace MITF potlačila expresi tyrosinázy (TYR) a genů souvisejících s tyrosinázou (TRP-1 a TRP-2) v buňkách SK-MEL-2 [9,10].ISL může inhibovat mono- a difenolázové aktivity houbové TYR, stejně jako themelanogenezi v melanocytech [11].
Melanin, hlavní pigment propůjčující barvu kůže, je syntetizován v epidermálních melanocytech a uložen v intracelulárních organelách zvaných melanosomy [12]. Melaninové pigmenty se skládají ze dvou typů: hnědý nebo černý eumelanin a červený nebo žlutý feomelanin [12]. Melanogeneze může být vyvolána vnějšími stimuly, včetně ultrafialového (UV) záření, reaktivních kyslíkových druhů (ROS) a chemikálií, jako je hormon stimulující melanocyty (-MSH) a isobutylmethylxanthin (IBMX), který zvyšuje hladiny cyklického adenosinmonofosfátu (cAMP). Melanin chrání pokožku před těmito podněty, zatímco jeho nadprodukce způsobuje hyperpigmentaci kůže, která může vést k onemocněním, jako je rakovina kůže [13–17]. Kůžebělenílátky, jako je kyselina kojová, hydrochinon, arbutin a kyselina askorbová, které jsou inhibitory TYR, byly použity k léčbě hyperpigmentace v několika kosmetických produktech [13,18]. Melanogeneze je regulována prostřednictvím různých signálních drah a tyto signály jsou spojeny s upregulací MITF. Aktivace MITF podporuje expresi TYR a TRP (TRP-1, TRP-2). Poté TYR katalyzuje oxidaci L-tyrosinu na 3,4-dihydroxy-L-fenylalanin (L-DOPA), který je následně oxidován na DOPAchinon. TRP-2 převádí dopachrom na 5,6-dihydroxyindol-2-karboxylovou kyselinu (DHICA) nebo 5,{15}}dihydroxyindol (DHI). Nakonec jsou DHICA a DHI oxidovány TRP-1, což vede k inmelanogenezi [19].
Tepelné procesy ovlivňují fyzikálně-chemické a biologické vlastnosti rostlinných extraktů. Ničí buněčné stěny a štěpí kovalentní vazby, což vede k uvolňování bioaktivních sloučenin [20,21]. Tepelná úprava extraktů pivovarského mláta nad 130 ◦Zvyšuje celkový obsah fenolů (TPC) a celkový obsah flavonoidů (TFC) s odpovídajícím zvýšením antioxidačních aktivit [16,20,21]. Zahřívání citrusových slupek může vést k uvolnění fenolických sloučenin a zvýšeníantioxidantčinnost [17].
Naším hlavním cílem je potvrdit potenciál Wongamu jako přirozené kůžebělenímateriál v kosmetice. Kromě toho má tato studie také prokázat, zda tepelné zpracování může zlepšit antioxidační a antimelanogenní aktivitylékořice. Vyšetřovali jsmeantioxidantčinnosti spolu s TPC extraktů Wongamu.Anti-melanogenníúčinky Wongamových extraktů byly ověřeny inhibiční aktivitou TYR a obsahem melaninu v buňkách melanomu.
Cistanche je přírodníkůžebělení bylina
2. Materiály a metody
2.1. Příprava vzorků
Vzorky byly připraveny podle dříve popsané metody [22].Lékořice(Wongam, Glycyrrhiza glabra x G. uralensis, identifikovaný Yun Ji Lee z NIHHS, RDA a registrovaný v Korea Medicinal Resources Herbarium s číslem voucheru MPS006326) byl kultivován a sklizen na Oddělení výzkumu bylinných plodin (Eumsung, Chungcheongbuk-do, Korea ) v roce 2018 a suší se při 60 ◦C po dobu 20 hodin. 10 kglékořicesklizeno a 1 kg bylo namleto. Po jejich smíchání byly získány 3 vzorky WC, resp. WH. Mletá lékořice (5 g) byla umístěna do skleněné nádoby s 1 ml destilované vody a ošetřena v autoklávu (Jisico, Soul, Korea) po dobu 1 hodiny při 130 ◦C (WH-130). Neošetřená kontrolní lékořice (WC , 5 g) a WH-130 byly odděleně extrahovány za použití 70% ethanolu (vzorek: rozpouštědlo, 1:50, objem:objem) po dobu 24 hodin při teplotě místnosti (RT). Po filtraci byly extrakty odpařeny ve vakuu, lyofilizovány a skladovány při -80 °C. Všechny extrakty byly solubilizovány v dimethylsulfoxidu (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO, USA) a methanolu (Sigma, St. Louis, MO, USA).
2.2. Stanovení Browningu
Index zhnědnutílékořiceExtrakty (WC a WH{0}}) byly zaznamenány na základě jejich hodnoty absorbance při 420 nm (A420) měřené pomocí čtečky mikrodestiček (BioTek, Winooski, VT, USA). Vyšší hodnoty absorbance při 420 nm odpovídají vyššímu indexu hnědnutí [23,24].
2.3. Celkový obsah fenolů (TPC)
Podle dříve publikované metody [25] byl TPC měřen na základě principu, že Folin-Ciocalteuovo činidlo je redukováno na modrý chromofor složený z afosfowolframového-fosfomolybdenového komplexu v závislosti na alkalických podmínkách a na koncentraci fenolických sloučenin. Každý vzorek (10 µL) byl smíchán s 2% uhličitanem sodným (200 µL) a poté Folin-Ciocalteuovým činidlem (10 µL). Směs byla aktivována po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Poté byla měřena absorbance při 750 nm pomocí čtečky mikrodestiček (BioTek, Winooski, VT, USA). TPC byla vypočtena ze standardní křivky kyseliny gallové a výsledky byly vyjádřeny jako ekvivalentní hodnoty kyseliny gallové, mg extraktu GAE g-1.
2.4. Stanovení antioxidační kapacity
Aktivita vychytávání radikálů byla měřena pomocí diamoniové soli 2,20-azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin 6-sulfonové kyseliny) (ABTS) podle dříve popsané metody s mírnou modifikací [19, 26]. Roztok radikálového kationtu ABTS byl vyroben smícháním 2,6 mM persíranu draselného a 7,4 mM ABTS a ponecháním reagovat po dobu 24 hodin při atRT. Roztok ABTS byl poté zředěn destilovanou vodou, aby se absorbance upravila na rozsah 1.{15}}–1,500. Dále bylo 20 ul vzorku zreagováno se 180 ul roztoku ABTS plus, chráněného před světlem, a směs vzorku a roztoku byla inkubována po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Absorbance byla měřena pomocí čtečky mikrodestiček (BioTek, Winooski, VT, USA) při 735 nm. Ze standardní křivky Trolox, ekvivalent Troloxuantioxidantkapacita (TEAC) byla vypočtena a vyjádřena v mg ekvivalentu troloxu (TE) na g suchého vzorku.
2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylový (DPPH) radikálový roztok byl připraven rozpuštěním 0,2 mM DPPH v 99% ethanolu. Roztok DPPH byl zředěn destilovanou vodou na anabsorbanci při 520 nm 1000–1500. Poté bylo 50 ul vzorku smícháno s 200 ul roztoku DPPH a ponecháno reagovat po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Po reakci byla stanovena absorbance směsi při 520 nm. Ze standardní křivky Trolox byl vypočten TEAC a vyjádřen v mg TE na g suchého vzorku.
2.5. Analýza vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií (HPLC).
Byla použita modifikovaná metoda HPLC [22]. Obsah ISLlékořiceextrakty byly analyzovány pomocí HPLC s UV-viditelným detektorem (HPLC: řada 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA; kolona: SynergiTM, 250 × 4,6 mm, 4 µm, Fusion-RP 8{{40}} Å, Phenomenex, Torrance, CA, USA). Mobilní fáze se skládala z rozpouštědla A (0,1 procenta kyseliny mravenčí ve vodě) a rozpouštědla B (0,1 procenta kyseliny mravenčí v acetonitrilu). Gradientový program pro mobilní fázi byl provozován s následujícím gradientem: 0–8 minut (20–20 procent B), 8–30 minut (20–38 procent B), 30–42 minut (38–50 procent B), 42–47 minut (50–90 procent B), 47–53 minut (90–90 procent B), 53–54 minut (90–20 procent B) a 54–60 minut (20–20 procent B) . Průtok, detekční vlnová délka a objem vstřikování byly nastaveny na 1,0 ml/min, 360 nm a 10 ul, v daném pořadí. Standardní roztoky ISL byly analyzovány se čtyřmi různými koncentracemi (0,05, 0,1, 0,2, 0,4 mg/ml). Ke stanovení obsahu ISL byla použita kalibrační křivka (y=ax plus b). V regresní rovnici x označuje koncentraci ISL (mg ml-1) a y znamená plochu píku.
2.6. Test inhibiční aktivity houbové tyrosinázy
Test inhibiční aktivity TYR byl proveden s použitím soupravy pro screening inhibitoru TYR (BioVision, Milpitas, CA, USA). Každý extrakt (WC a WH-130) byl rozpuštěn v DMSO na konečnou koncentraci 250 ug/ml. Kyselina kojová, použitá jako pozitivní kontrola, byla také zředěna na 250 ug/ml v DMSO. Stručně řečeno, 20 ul extraktu nebo kyseliny kojové bylo spojeno s 50 ul roztoku enzymu TYR. Po inkubaci při teplotě místnosti po dobu 10 minut bylo do každé jamky přidáno 30 ul roztoku substrátu TYR. Konečná koncentrace extraktů a kyseliny kojové byla 50 ug/ml. Optická hustota jamek byla poté měřena při 510 nm v kinetickém režimu po dobu 1 hodiny pomocí čtečky mikrodestiček (BioTek, Winooski, VT, USA).
cistanche prášek: antioxidační
2.7. Buněčná kultura
Buňky myšího melanomu B16F10 byly získány z American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Buňky B16F10 byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (DMEM) doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra (FBS), 100 jednotkami/ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu (Gibco, Grand Island, NY, USA) obsahujícím ve zvlhčené atmosféře 5 procenta CO2 při 37 ◦C.
2.8. Test buněčné životaschopnosti
Cytotoxicitalékořiceextraktů (WC a WH-130) do buněk B16F10 byl stanoven pomocí MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,{{8 }}difenyltetrazolium bromid]. Buňky B16F10 byly kultivovány v množství 4 x 103 buněk/jamku na 96-jamkové destičce po dobu 24 hodin. Poté byly k buňkám přidány extrakty v koncentracích 50, 100 a 200 ug/ml a inkubovány při 37 °C po dobu 48 hodin. Poté byl do každé jamky přidán roztok MTT (500 ug/ml) a destička byla inkubována po dobu 1 hodiny při 37 °C. Médium v každé jamce bylo odstraněno a bylo přidáno 100 ul DMSO. Po protřepávání po dobu 30 minut byla měřena absorbance při 540 nm pomocí čtečky mikrodestiček. Všechny testy byly provedeny trojmo.
2.9. Měření obsahu buněčného melaninu
Intracelulární obsah melaninu byl měřen pomocí mírně upravené verze metody popsané dříve [27]. Buňky melanomu B16F10 byly nasazeny do 6-jamkových destiček v hustotě 8 x 104 buněk/jamku a inkubovány po dobu 24 hodin. Buňky byly vystaveny extraktům (WC a WH-130, 100 µg/ml), kyselině kojové (100 µg/ml) nebo ISL (10 µM, Millipore Sigma, Burlington, MA, Spojené státy americké) po dobu 48 hodin v přítomnost 100 uM 3-isobutyl-1-methylxanthinu (IBMX). Po ošetření byly buňky promyty Dulbeccovým fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem (DPBS) a rozpuštěny ve 200 ul 1N NaOH po dobu 2 hodin při 90 °C. Absorbance při 405 nm byla měřena pomocí čtečky mikrodestiček.
2.10. Test buněčné tyrosinázové aktivity
Intracelulární aktivita TYR byla měřena pomocí mírně upravené verze dříve popsané metody [27]. Buňky melanomu B16F10 (8 x 104 buněk/jamka) byly ošetřeny extrakty (100 ug/ml) nebo kyselinou kojovou (100 ug/ml) v přítomnosti 100 uM IBMX po dobu 48 hodin, shromážděny a promyty DPBS. Vzorky proteinů byly lyžovány v 1% TrionX-100 (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) s pufrem fosforečnanem sodným (pH 6,8) a poté centrifugovány při 15,000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut. Frakce supernatantu byla shromážděna a koncentrace proteinu byla stanovena pomocí testovací soupravy s kyselinou bicinchonovou (BCA) (Waltham, MA, USA). Reakční směs sestávající z 30 ug proteinu (upraveno na 100 ul s 1 procentem Trionu X-100) a 100 ul 10mM L-DOPA byla přidána do každé jamky 96-jamkové destičky. Po inkubaci při 37 °C po dobu 1 hodiny byl dopachrom monitorován měřením absorbance při 490 nm pomocí čtečky mikrodestiček. Aktivita TYR byla vypočtena podle následujícího vzorce:
Aktivita tyrosinázy ( procento )=(OD405 vzorku/OD405 kontroly) × 100
2.11. Polymerázová řetězová reakce v reálném čase (RT-PCR)
Hladiny exprese mRNA genů souvisejících s melanogenezí včetně MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 byly stanoveny pomocí modifikovaného testu RT-PCR [28]. Stručně, buňky B16F10 byly nasazeny na 6-jamkové destičky v hustotě 8 × 104 buněk na jamku a kultivovány po dobu 24 hodin. Poté byly buňky ošetřeny extrakty (100 ug/ml), kyselinou kojovou (100 ug/ml) nebo ISL (10 uM) po dobu 48 hodin. Celková RNA byla izolována z buněk pomocí činidla TRIzol (Ambion, Austin, TX, USA) a poté byla koncentrace RNA kvantifikována pomocí čtečky mikrotitračních destiček. Po přípravě cDNA (2 µg) pomocí sady Reverse Transkriptase Premix Kit (ElpisBiotech, Daejeon, Korea) podle protokolů výrobce byla provedena PCR v reálném čase pomocí MITF, TYR, TRP-1, TRP-2 a -aktinové primery (tabulka 1, Bioneer, Daejeon, Korea) se soupravou SYBR Green (ProGEN, Heidelberg, Německo) v CFX96 Real Time PCR instrument (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Všechna data byla normalizována na hladiny -aktinmRNA jako referenčního provozního genu.
2.12. Příprava buněčných lyzátů a Western blot analýza
Buňky B16F10 byly nasazeny na 6-jamkové destičky v hustotě 8 × 104 buněk na jamku, inkubovány po dobu 24 hodin a poté vystaveny extraktům (100 ug/ml), kyselině kojové (100 ug/ml ) nebo ISL (10 uM) po dobu 48 hodin. Po promytí DPBS byly buňky sklizeny a lyžovány v Triton X-100pufru (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) obsahujícím 1 procento koktejlu proteázy a inhibitoru fosfatázy. Koncentrace proteinů lyzátů celých buněk byly měřeny pomocí testovací soupravy BCA (Waltham, MA, USA). Stejná množství proteinu (20 ug) byla nanesena na 10% gely dodecylsulfát-polyakrylamidu sodného, které probíhaly po dobu 4 hodin při 70 V. Poté byly proteiny přeneseny na polyvinylidenfluoridovou (PVDF) membránu. Membrána byla třikrát promyta Tris-pufrovaným fyziologickým roztokem [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl] obsahujícím 0,1 procenta Tween 20 (TBST) a blokována 2 procenty hovězího sérového albuminu (GenDEPOT) po dobu 1 hodiny. Dále byly membrány inkubovány přes noc při teplotě 4 °C s primárními protilátkami (ředění 1:1000) po dobu 4 hodin při teplotě místnosti. MITF, TYR, TRP-1, TPR-2 a -actin byly detekovány králičí polyklonální anti-MITF protilátkou (Abcam, Cambridge, UK); kozí polyklonální anti-TYR protilátka (Santa Cruz, Dallas, TX, USA); a myší monoklonální antiTRP-1, anti-TRP-2 a anti{41}}aktinové protilátky (Santa Cruz, Dallas, TX, USA), v tomto pořadí. Poté byly membrány několikrát promyty TBST a inkubovány se sekundárními protilátkami (ředění 1:2000) po dobu 1 hodiny, jmenovitě králičí anti-myší IgG, myší antikozí IgG a kozí anti-myší IgG (Santa Cruz, Dallas, TX, USA), s následným několika promytí TBST. Cílové proteiny byly detekovány pomocí reagencie zesílené chemiluminiscence (ECL) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) pomocí systému ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Kvantifikace proteinových pásů byla provedena pomocí softwaru ImageJ (verze 1.52a pro Windows; NIH, Rockville, MD, USA) [28].
2.13. Statistická analýza Data byla analyzována pomocí Microsoft Excel 2016 a všechny experimentální výsledky jsou uvedeny jako průměr ± standardní odchylka (SD) tří nezávislých měření. K posouzení rozdílů mezi kontrolou a vzorky byl použit studentův dvouvzorkový t-test. Jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA) a Duncanův test byly provedeny pomocí softwaru Rsoftware (verze 3.6.3), aby se určila významnost každého srovnání při úrovně p < 0.05="" (*),="" p="">< 0,01="" (**)="" a="" p="">< 0,001="" (***).="" korelační="" analýza="" byla="" provedena="" pomocí="" prism5.02="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">
3. Výsledky
3.1. Index hnědnutí výtažků z lékořice
Stupeň zhnědnutílékořiceextrakty je znázorněno na obrázku 1a. Tyto výsledky potvrdily, že tepelně upravený extrakt (WH-130, 0,965 ± 0.025 AU [jednotky absorbance]) měl mnohem vyšší hodnoty indexu hnědnutí než nezahřívaný extrakt (WC, 0,758 ± 0,005 AU). Očekáváme, že tepelné zpracování zvyšuje tvorbu melanoidinu ve WH-130 a že tato změna může souviset s různými biologickými aktivitami.
3.2. Celkový obsah fenolů (TPC) výtažků z lékořice
Obrázek 1b ukazuje TPClékořiceextrakty. Zjistili jsme rozdíl v TPC mezi WC a WH{{0}}, protože WC mělo TPC 12.{8}}93 ± 0,061 mg GAE/g extraktu, zatímco WH-130měl TPC 14,098 ± 0,781 mg GAE/g extraktu. Tepelné zpracování zvýšilo TPC extraktů z lékořice.
3.3. Radikál-scavening aktivita výtažků z lékořice
Theantioxidantčinnostlékořiceextrakty jsou uvedeny na obrázku 1c,d. Kapacita ABTS plus pohlcování radikálů byla vyšší u extraktu WH-130 (6.086 ± 0,304 mg TEAC/gextrakt) než u extraktu WC (3,542 ± 0,093 mg TEAC/g extraktu). V testu DPPH byla pozorována podobná tendence. WH-130 (7,442 ± 0,292 mg extraktu TEAC/g) extrakt vykázal větší aktivitu vychytávání radikálů DPPH než extrakt WC (4,033 ± 0,160 mg TEAC/gextrakt). Tyto výsledky naznačují, že zahřívání může zvýšit antioxidační aktivitu extraktů.
3.4. Obsah izoliquiritigeninu ve výtažcích z lékořice
Výsledky ukázaly, že obsah ISL v WC se po tepelném zpracování výrazně zvýšil (tabulka 2, obrázek 2), což naznačuje, že tepelné zpracování může ovlivnit obsah tohotoantioxidantaanti-melanogennísloučenina.
cistanche tubolosa
3.5. Životaschopnost buněk
Jak je znázorněno na obrázku 3,lékořiceextrakty neovlivnily životaschopnost buněk při 50 nebo 100 ug/ml vzhledem ke kontrole ošetřené IBMX. Při ošetření 50 a 100 ug/ml všech extraktů zůstala životaschopnost buněk vyšší než 100 procent. Proto byly provedeny další experimenty s koncentracemi extraktu z lékořice až 100 ug/ml.
3.6. Účinky extraktů z lékořice na produkci melaninu v buňkách melanomu B16F10
Pigmentace a obsah melaninu v buňkách B16F10 jsou znázorněny na obrázku 4a,b. Obsah melaninu v buňkách B16F10 se zvýšil až 3.4-krát s ošetřením IBMX ve srovnání s neošetřenou kontrolou. WC a WH-130 vykazovaly významně sníženou pigmentaci a obsah melaninu ve srovnání se skupinou léčenou IBMX (obrázek 4a,b). WC i WH{{10}} vykazovaly nižší obsah melaninu než buňky ošetřené KA. Inhibiční účinek syntézy melaninu v buňkách B16F10 ošetřených WH-130 byl větší než WC. Množství melaninu přítomného po ošetření 100 µg/ml WC a WH-130 bylo sníženo přibližně na 0,{18}}násobek a 0{20}}násobek úrovně u pacientů léčených IBMX group.ISL (10 µM) a KA (100 µg/ml) potlačily produkci melaninu na 0,{25}}násobek a 0{27}}násobek, v závislosti na hladině v buňkách ošetřených IBMX.
Tento výsledek ukazuje, že tepelně zpracovánolékořiceextrakt (WH-130) může inhibovat produkci melaninu účinněji než nezahřívaný extrakt (WC). Kromě toho jsme pozorovali, že ošetření extraktem WH-130 v množství 25, 50 a 100 µg/ml (obrázek 4c) vedlo ke snížení obsahu melaninu v melanomových buňkách B16F10 v závislosti na koncentraci. Společně tyto výsledky ukazují, že vytápění zlepšiloanti-melanogenníaktivita extraktu z lékořice.
3.7. Účinky extraktů z lékořice na aktivitu tyrosinázy
3.7.1. Aktivita houbové tyrosinázy
Účineklékořiceextrakty na aktivitu houby TYR je znázorněn na obrázku 5a. Potvrdili jsme, že k účinku extraktů (WC a WH-130) na oxidaci substrátů houbovým TYR došlo v bezbuněčných podmínkách. Při 50 µg/ml inhiboval WC extrakt aktivitu enzymu na 81,33 procenta, zatímco WH-130 potlačil aktivitu TYR na 65,95 procent ECúrovně. Mezitím kyselina kojová (KA), inhibitor TYR, způsobila inhibici enzymové aktivity na 47,09 procent úrovně EC. Inhibice aktivity TYR byla větší u tepelně upravené lékořice (WH-130) než u nezahřívané lékořice (WC).
3.7.2. Aktivita buněčné tyrosinázy
Jak je znázorněno na obrázku 5b, aktivita TYR buněk ošetřených IBMX se zvýšila na 233 procent vzhledem k neošetřené kontrole (100 procent). WC snížilo aktivitu TYR na 82,17 procent ve srovnání se skupinou léčenou IBMX. Extrakt WH-130 inhiboval buněčnou aktivitu TYR na 59,88 procent ve srovnání s buňkami ošetřenými IBMX. KA snížila buněčnou aktivitu TYR na 74,07 procent úrovně v buňkách ošetřených IBMX. Tyto výsledky společně ukazují, že extrakty z lékořice (WC a WH-130) potlačují aktivitu TYR a že WH-130 má silnější inhibiční aktivitu vůči TYR než WC a KA.
Dále jsme zkoumali korelace mezi TPC, obsahem ISL,antioxidantaktivita a anti-melanogenní aktivita (tabulka 3). TPC pozitivně korelovalo s obsahem ISL (0.827), stejně jako s aktivitami ABTS plus a DPPH zachycujícími radikály (0.886 a 0.896, v tomto pořadí), zatímco TPC byla nepřímo korelována s obsahem melaninu (–0 0,859). Obsah ISL pozitivně koreloval s aktivitami ABTS plus a DPPH zachycujícími radikály (0.977 a 0.985, v tomto pořadí), zatímco obsah ISL nepřímo koreloval s aktivitou TYR (–0. 834) a obsah melaninu (–0.995). Antioxidační aktivity (ABTS plus a DPPH) nepřímo korelovaly s aktivitou TYR (–{{20}}.879 a –0.856, v tomto pořadí) a obsahem melaninu (–0. 974 a –0,984). Tyto výsledky ukazují, že fenolické sloučeniny, jako je ISL v lékořici, jsou úzce spojeny s antioxidantem aanti-melanogenníaktivity výtažků z lékořice.
3.8. Účinky extraktů z lékořice na expresi mRNA genů souvisejících s melanogenezí
Zkoumali jsme expresi genů souvisejících s melanogenezí v buňkách B16F10, abychom objasnili účinky extraktů z lékořice na melanogenezi. WC i WH-130 potlačovaly expresi mRNA MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 (obrázek 6). WC inhibovalo expresi mRNA MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 na úrovně 0.{{10}}krát, 0.{101} {12}}složit, 0.71-složit a 0.{16}}složit v buňkách ošetřených IBMX. WH-130 inhibovala expresi mRNA MITF, TYR, TRP-1 a TRP{{20}} až 0.43-násobně, {{33 }}.60-složit, 0.62-složit a 0.49-složit, v tomto pořadí, úrovní skupin ošetřených IBMX. WH{{30}} extrakt měl silnější inhibiční účinek na expresi mRNA než WC extrakt. ISL také potlačila vyjádření MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 (0.42-násobek, 0.59-násobek, 0{38}}násobek a 0.{40}}násobek vzhledem k buňkám ošetřeným IBMX). Ve skupině léčené WH-130- byl rozsah snížení exprese mRNA genů souvisejících s melanogenezí větší než ve skupině léčené WC, což naznačuje, želékořiceextrakty inhibují melanogenezi potlačením transkripce genů souvisejících s melanogenezí a tepelná úprava zlepšujeanti-melanogenníaktivita extraktu z lékořice.
3.9. Účinky extraktů z lékořice na expresi proteinů genů souvisejících s melanogenezí
Jak je znázorněno na obrázku 7b, léčba WC a WH-130 významně snížila hladiny proteinové exprese MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2. Hladiny exprese MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 byly v buňkách ošetřených WC potlačeny (0.79-násobek, 0.{{9 }}složit, {{10}}.89-složit a 0.{13}}složit relativně k buňkám ošetřeným IBMX). WH-130 vykázala snížené hladiny proteinové exprese MITF, TYR, TRP-1 a TRP-2 ({{20}}.74-násobně, {{24 }}.73-složit, 0.80-složit a {{30}}.48-složit, v daném pořadí, vzhledem k buňkám ošetřeným IBMX) . ISL snížila hladiny proteinové exprese MITF, TYR a TRP-2 (0,{29}}násobně, 0{31}}násobně a 0{33}}násobně ve srovnání s léčbou IBMMX buňky). WH-130 potlačoval proteinovou expresi genů souvisejících s melanogenezí silněji než WC, což ukazuje, želékořiceextrakty inhibují melanogenezi přesupresi translace genů souvisejících s melanogenezí a tepelná úprava zlepšujeanti-melanogenníaktivita extraktu z lékořice.
bělící prášek cistanche na kůži
4. Diskuze
Výsledky této studie ukazují, že tepelné zpracovánílékořiceovlivňuje TPC, antioxidační aktivitu aanti-melanogenníaktivita. WH-130 měl vyšší index zhnědnutí a hodnoty TPC než WC. Podmínky zpracování, včetně teploty a tlaku, ovlivňují složky vzorků. [29]. Zahřívání může podporovat Maillardovy reakce, které jsou spojeny s produkcí melanoidinu [23]. Melanodiny mají některé biologické účinky, včetněantioxidantprotinádorové a antihypertenzní aktivity, stejně jako modulace krevního cukru [30]. Tyto sloučeniny jsou polymerní hnědě zbarvené makromolekuly vzniklé Maillardovou reakcí z interakcí mezi cukry a aminokyselinami při vysokých teplotách [21]. Čím více melanoidinů je v zahřátém extraktu, tím vyšší je index hnědnutí. Barva nezahřívaného lékořicového extraktu (WC) byla světle hnědá, ale barva byla postupně tmavší s vysokou teplotou (130 stupňů). Proces zahřívání může také vyvolat některé změny v chemických strukturách fenolických sloučenin a způsobit rozpad buněčných stěn rostlin, uvolňování fenolických látek, což vede k antioxidačním aktivitám [31]. Obsah fenolů v extraktech z lékořice se tedy může tepelnou úpravou zvýšit [21]. Předchozí zprávy ukázaly, že tepelná úprava medu zvýšila tvorbu melanoidinu a stupeň zhnědnutí se shodoval se zvýšením antioxidační aktivity [24]. Proto WH-130 prokázal vyšší antioxidační kapacitu než WC v testech ABTS plus a DPPH radikál-scavenging, které byly široce používány ke stanovení antiradikálových aktivit vzorků na základě schopnosti přenášet elektrony nebo atomy vodíku [32].
Nejběžnější přírodníantioxidanta anti-melanogenní sloučeniny jsou fenoly. Tricin a 9-hydroxyoktadekadienová kyselina byly identifikovány jako hlavní fenolické látky v Sorghum bicolor. Navíc tyto složky vykazovaly antioxidační a antimelanogenní účinky inhibicí aktivity tyrosinázy [19]. Kromě toho bylo prokázáno, že kyselina p-kumarová, anaktivní sloučenina Sasa quelpaertensis Nakai, silně inhibuje aktivitu tyrosinázy a snižuje produkci melaninu v melanomových buňkách [27]. Podle předchozích výzkumů ISL, dobře známá flavonoidní sloučenina v produktu hydrolýzy kořene lékořice [6–8], vykazuje antioxidační a antimelanogenní aktivity inhibicí aktivity TYR, transportu melanosomu a indukcí degradace melaninu [10,31]. Takže jsme se zaměřili na obsah ISL v extraktech a působení ISL v mechanismech souvisejících s melanogenezí. ISL se používá jako terapeutické činidlo pro mnoho onemocnění díky svým četným biologickým aktivitám, včetně protizánětlivých, antimikrobiálních, antioxidačních, protirakovinných, imunoregulačních, hepatoprotektivních a kardioprotektivních účinků [33]. V této studii byl naměřen vyšší obsah ISL ve WH-130 než ve WC. Hyperpigmentace kůže souvisí s oxidačním stresem. Uvádí se, že lapače volných radikálů hrají důležitou roli při potlačování hyperpigmentace [17,34]. Tyto výsledky společně ukazují, že tepelná úprava lékořice může zlepšit její aktivity pohlcující radikály aanti-melanogenníaktivity prostřednictvím zvyšujících se hladin antioxidačních fenolických sloučenin, jako je ISL. Podle předchozí literatury jsou v lékořici (Glycyrrhiza uralensis, G. glabra) glabren, glabridin, glabrol, liquiritigenin, vykazující inhibici tyrosinázy. Tyto sloučeniny tedy mohou mít také vliv na antimelanogenní aktivity [10,11,15,35]. Další studie o nich jsou důležité pro objasnění antimelanogenních účinků lékořice.
Syntéza melaninu je regulována TYR, TRP-1, TRP-2 (dopachromová tautomeráza) a MITF (obrázek 8). TYR, glykoprotein obsahující měď, působí jako enzym omezující rychlost a hraje klíčovou roli při produkci melaninu. TYR katalyzuje hydroxylaci tyrosinu na 3,4-dihydroxyfenylalanin (DOPA). TYR také katalyzuje oxidaci DOPA na dopachinon a konverzi dopachinonu na dopachrom. Poté je dopachrom přeměněn na dihydroindolizin (DHI) nebo indol 5, 6-chinon-2-karboxylovou kyselinu (DHICA) [36–38]. V této dráze TRP-2 katalyzuje přeměnu dopachromu na DHICA, který je oxidován TRP-1 za vzniku eumelaninu. MITF je specifický transkripční faktor, který hraje klíčovou roli v melanogenezi jako hlavní regulátor exprese TYR, TRP-1 a TRP{16}} (obrázek 8) [28,37]. Chemickým induktorem melanogeneze je 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), který zvyšuje aktivitu TYR prostřednictvím signální dráhy cAMP [13]. IBMX zvyšuje intracelulární koncentraci cAMP inhibicí cAMP fosfodiesterázy. Zvýšení hladin cAMP aktivuje proteinkinázu A (PKA) a aktivovaná PKA zlepšuje aktivitu a expresi vazebného proteinu souvisejícího s cAMP (CREB) [39]. CREB se váže na promotor MITF, což vede k upregulaci genové exprese MITF. Aktivace MITF podporuje expresi TYR a TRP [13,19]. Proto downregulace MITF vede k hypopigmentaci.
Zahřátý extrakt z lékořice (WH-130) inhiboval aktivitu TYR hub a buněčnou aktivitu TYR účinněji než nezahřívaný extrakt z lékořice (WC). Inhibice buněčné TYR aktivity v extraktech z lékořice může být způsobena downregulací TYR. Tyto výsledky jsou spojeny s obsahem melaninu v melanomových buňkách B16F10. U buněk B16F10 léčba WH-130 potlačila produkci melaninu indukovanou IBMX lépe než léčba WC. Navíc WH 130 downreguloval transkripci a translaci markerů souvisejících s melanogenezí (MITF, TYR, TRP-1, TRP-2) v buňkách B16F10 ve větší míře než WC. Tyto markery mohou společně přispívat k celkovémuanti-melanogenníčinnost [40].
Zahřívánílékořiceextrakt zvýšil množství antioxidačních fenolických sloučenin, jako je ISL, a toto zvýšení bylo spojeno se zvýšenímantioxidantčinnosti (ABTS plus a DPPH). Zahřátý extrakt z lékořice (WH{0}}) také vykazoval zvýšenou inhibiční aktivitu TYR a sníženou syntézu melaninu. Vzhledem k potenciálu bezpečnosti existuje nový trend ve vývoji přírodních materiálů. Lékořice se používá v kosmetických krémech na hyperpigmentaci [41]. Předvedli jsme potenciál Wongamu jako novéhobělení kůžeprostředek pro použití v kosmetice a ověřeno, že tepelná úprava může zlepšit jeho potenciál.
Glycyrrhiza uralensis Fischer (lékořice) má antioxidační a UV fotoprotektivní aktivity v lidských dermálních fibroblastech [22]. Nicméně, studie srovnání mezi Wongam (lékořice) a jinými původními druhy je třeba provést později. Kromě toho by měly být za použití vhodných metod provedeny další studie neidentifikovaných složek Wongamu, jako je glabren, glabridin, spojené s jeho antimelanogenním účinkem. Po analýze složek v extraktu z lékořice je nutné zkoumat synergické nebo antagonistické účinky mezi fenolickými sloučeninami [40]. Zkoumat, jak tyto látky působíantioxidanta antimelanogenní mechanismy, přenos atomů vodíku nebo systémy přenosu jednoho elektronu a mitogenem aktivované proteinkinázové signální dráhy [32,37].
5. Závěry
V této studii jsme zkoumali potenciál extraktů z Wongamu, nového kultivarulékořice, jakoběleníprostředek pro aplikaci v kosmetice a vliv tepelného ošetření na jejich bioaktivitu. Wongamové extrakty (WC a WH-130) vykazovaly vysokou aktivitu vychytávání radikálů a inhibovaly syntézu melaninu v melanocytech indukovaných IBMX potlačením aktivity TYR. Tepelné zpracování zvýšiloantioxidanta anti-melanogenní aktivity Wongamu. Výsledkem bylo, že WH-130 vykazovala vynikající antioxidační aanti-melanogenníaktivity než WC. Naše výsledky naznačují, že tepelně upravený extrakt z Wongamu (WH-130) je účinné činidlo snižující pigment s možnou aplikací při různých dermatologických poruchách hyperpigmentace, včetně hnědých skvrn, pih a melasmat, a ukazují, že tepelné zpracování lze použít ke zlepšení antimelanogenní aktivita lékořice.
výhody cistanche tubolosa: bělení kůže