Antioxidační potenciál a potenciál proti stárnutí peptidové formulace (Gal2-Pep) konjugované s kyselinou galovou

Kůže je velmi náchylná k předčasnému stárnutív důsledku vnějšího stresu se proto v této studii používá peptidová formulace (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) byl syntetizován kombinací TPPTTP peptidu a gallickyselina (GA). Všechny peptidy byly syntetizovány na 2-chlorotritylchloridové pryskyřici s použitím peptidu v pevné fázisyntéza (SPPS) a analyzována na elektrosprejové ionizaci (ESI)/kvadrupólový-čas-of-flflight (Q-TOF) tandemový systém hmotnostní spektroskopie (MS). Zpočátku Gal2–Pep nevykazoval žádnou toxicitu pod koncentrací 100mM s mírou přežití buněk 88 procent pro keratinocyty afibroblasty. Thereaktivní formy kyslíku(ROS) úklidová činnost Gal2–Pep byl stabilnější ve srovnání se samotným GA; a po čtyřech týdnech na pokojiteplota, jehoČinnost čištění ROSzůstala vyšší než 50 procent . Navíc peptidová formulace,Gal2–Pep také vykazoval inhibiční účinek na elastázu v CCD-1064Skfibroblastbuňky. Na základě výsledků RT-qPCR bylo v této studii prokázáno, že Gal2–Pep zvýšil expresi PGC-1a nazabránitoxidační stresa potvrdila svůj potenciál jako anprostředek proti stárnutípodlezvýšení expresekolagen typu Ia podlesnížení exprese matricové metaloproteinázy-1 (MMP1). Thezjištění získané posilují návrh, že by peptidová formulace syntetizovaná v této studii mohla být použita jako apřírodní antioxidantaprostředek proti stárnutípro své kosmetické aplikace.

Kliknutím sem získáte více informací o produktech proti stárnutí Cistanche

1. Úvod

Stárnutí kůževzniká v důsledku postupného snižování a případného zastavení buněčného dělení keratinocytů a brovýbuchy v kůži. Vrásky na pokožce se vyvíjejí, když se počet buněk snižuje, s výslednou denaturací extracelulární matrice, která vede k vysušení a ztrátě elaticity v kůži.1 Poškození intracelulární mitochondriální DNAa dochází také ke snížení rychlosti syntézy proteinůběhem procesu stárnutí pleti.2 Stárnutí pleti má dvě hlavní cestyzpůsoby, vnitřní a vnější, s ultrafialovým (UV) vystavením

hlavním řidičemvnější stárnutí. UV světlo reaguje s hlavními složkami pokožkyvčetně lipidů, proteinů a nukleových kyselin k produkci reaktivních forem kyslíku (ROS), které vedou k buněčnésmrt.3–5 Nadměrné hladiny ROS také vedou ke štěpení aabnormální vazba kolagenových nebo elastinových řetězců a podpora exprese matricových metaloproteináz (MMP), jako je MMP-1, které rozkládají kolagen, což vede k vráskám kůže aurychlení stárnutí pleti.6,7 Proto antioxidační terapie odstranitROS a pro aktivaci mitochondriálního potenciálu má zásluhu na ochraně pokožky před stárnutím.

Kromě ROS se na ztrátě významně podílí elastázapružnost pokožky, která rozkládá elastin, důležitý proteinextracelulární matrix.8 Elastin díky svému výraznému elastickému zpětnému rázuvlastnosti, poskytují pokožce pružnost, zatímco elastáza máschopnost štěpit elastin a další proteiny.8 Proto inhibujteAktivace enzymu elastázy by mohla být klíčovou strategií pro pokles kůže zabraňuje ztrátě elasticity pokožky.

V této studii jsme navrhli nový materiál, který kombinujekoaktivátor receptoru gama aktivovaný peroxisomovým proliferátorem1-alfa (PGC-1a)-odvozený peptid TPPTTP a kyselina gallová (GA)pro použití v kosmetice proti stárnutí. GA je fytochemikálie nacházející se v různém ovoci a zelenině, včetně hroznů, rajčat a zeleného čaje, o které je známo, že má vysoký antioxidační a antibakteriální účinek. effects.9 Ačkoli se GA používá v kosmetickém a potravinářském průmyslu kvůli těmto prospěšným napřffjeho formulace bývá nestabilní.10 Takto jsme vyvinuli (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) za účelem zvýšení stability GA jejím navázáním na PGC-1a-odvozený peptid TTPTTP.

V této studii jsme syntetizovali (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2– Pep) peptidová formulace v konjugaci s kyselinou galovou a potvrzenajeho potenciál jako antioxidantu a činidla proti stárnutí.

2. Materiály a metody

2.1. Materiály

Dulbecco's ModifiedEagleovo médium (DMEM), penicilin/streptomycin, fetální hovězí sérum (FBS), fosfát-bufferedfyziologický roztok (PBS) a trypsin byly zakoupeny od Gibco (Carls

špatné, CA). Hydroxybenzotriazol (HOBt), diisopropylkarbodiimid (DIC), 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en (DBU),N, N-diisopropylethylamin (DIEA), kyselina gallová aN-sukcinyl-tri-alanyl-pnitroanilid byly získány od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).L-Tvoří aminokyseliny (Fmoc-Lys (Boc)–OH, Fmoc-Thr (tbu)–OH a Fmoc-Pro–OH) byly zakoupeny od Bead-Tech (Seoul,Korea).

2.2. Syntéza peptidů a peptidů spojených s kyselinou galovou

Všechny peptidy byly syntetizovány na 2-chlorotritylchloridové pryskyřici (200mmolová stupnice, substituční hodnota¼ 1,46 mmol g 1) pomocí HOBt–DIC zprostředkovaná syntéza peptidů na pevné fázi (SPPS).

Syntéza peptidů metodou SPPS byla prováděna s mírnými modykationtů odkazujících na předchozí studie.11–13 2-chlorotritylchloridová (CTC) pryskyřice byla nabobtnána v dichloru

methan (DCM, 8 ml) po dobu 30 minut. Pryskyřice byla promyta sdimethylformamid (DMF). Všechny reakce byly prováděny při teplotě místnosti. Deriváty aminokyselin chráněné Fmoc (2 ekvivalenty(Equiv.), profiprvní připojená aminokyselina nebo 5 ekv., pro ostatní aminokyseliny) byly spojeny buď s DIEA (5 ekv., pro připojenou aminokyselinu) nebo HOBt/DIC (6 ekv./5 ekv.) v DMF aftehmprovedení deprotekce Fmoc za použití 2 procent (obj./obj.) DBU v DMF (2krát, vždy 2 minuty, 8 ml). A všechny kroky byly promyty 5krát DMF. Finální kyselina gallová byla spojena s peptidy navázanými na lysin.Po kondenzaci kyseliny gallové byla pryskyřiceafiltrovaný, vypraný,a suší se ve vysokém vakuu. Štěpící roztok (TFA:deionizovaná [DI] voda: TIS¼ 95 : 2,5 : 2,5, obj./obj. procenta) byla ošetřena po dobu 2 hodinpro získání surových peptidů. Surové peptidy byly vysráženy a promyty třikrát studeným diethyletherem.

Analytická vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi(RP-HPLC) byla provedena na Waters 2695 SeparationsModul s kolonou Capcell Pak C18 (4,6 mm 250 mm, 5mm, Shiseido). Mobilní fáze sestávala z 0,05 procenta TFA v H2O (mobilní fáze A) a 0,05 procenta TFA v acetonitrilu (mobilní fáze B).

Eluce bylo dosaženo použitím lineárního gradientu pro mobilní zařízenífáze B 5 procent až 65 procent během 30 minut při aprůtok 1.0 ml min 1. Peptidové píky byly detekovány při vlnové délce 230 nm. Semipreparativní RP-HPLC byla provedena na systému Waters HPLC (Pump 600E, Detector UV-484) s Gemini RP-C18sloupec (21,2 mm 250 mm, 5mm, Phenomenex). Mobilní fáze sestávala z 0,05 procenta TFA v H2O (mobilní fáze A)a 0,05 procenta TFA v acetonitrilu (mobilní fáze B). Eluce bylo dosaženo použitím lineárního gradientu pro mobilní fázi B of7 procent až 22 procent během 15 minut při alprůtok 10 ml min 1. Thepeptidové píky byly detekovány spektrofotometricky při vlnové délce 230 nm.

Syntetizované peptidy byly rozpuštěny v 5% kyselině mravenčí ve vodě a analyzovány na elektrosprejové ionizaci (ESI)/quadrupole-time-of-light (Q-TOF) tandemová hmotnostní spektroskopie(MS) systém (TripleTOF6600, ABSciex, Foster City, CA). Vzorky byly vstřikovány do systému Q-TOF vybavenéhonano-sprejový zdroj v alsazba 1mL min 1. ESI iontparametry zdroje byly následující: iontové rozprašovací napětí 1,5 kV, clonový plyn při 10 psi a plášťový plyn při 5 psi. Spektra vrežimu plného skenování a MS/MS byly shromážděny v rozsahum/z

100–1200 Da při akumulační době 25 ms na spektrum.Energie srážky se zvýšila z 10 na 80. Výsledekdata byla získána pomocí Analyst TF soware a automatickypřiřazeno těžištěm 80 procent s minimální špičkou, snížením šumu o 10 procent, středním deisotopingem s prahem 3 procent, bez redukce šumu a bez vyhlazování. Byly identifikovány syntetizované peptidys hmotnostní tolerancí 0.05 Da a ručně sekvenováno pomocí MS/MS tolerance 0.01 Da.

2.3. Buněčné kultury a testy životaschopnosti

Lidské, dospělé buňky s nízkým obsahem vápníku a vysokou teplotou (HaCaT).a CCD-1064Sk (normální lidská kůžefibroblastové) buňky bylykultivováno v DMEM s 10 procenty FBS a 1 procentem penicilinu/streptomycin. Buňky byly inkubovány při 37 °C C ve zvlhčené vzduchové komoře s 5 procenty CO2.Pro testy životaschopnosti byla použita souprava pro počítání buněk-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Beijing, Čína). Buňky HaCaT a CCD-1064Skbyly nasazeny na 96-jamkové mikrodestičky (5 103 buněk na jamku) a inkubovány při 37 C v 5 procentech CO2 po dobu 24 hodin. Kultury byly poté vystaveny různým koncentracím syntetizovaných peptidů nebo GA a inkubovány při 37 C v 5 procentech CO2 po dobu 24 hodin. Životaschopnost buněkbyla následně měřena pomocí CCK-8 podle pokynů výrobce.

2.4. Stanovení antioxidační aktivity

2.4.1. DPPH test.Antioxidační aktivita syntetizovanéhopeptidy a GA byla hodnocena individuálně pomocí DPPH testu. Testy DPPH byly provedeny podle dříve uvedeného

metodika s drobnými úpravamikation.12,14–16 Nejprve 0,12 mg ml 1 Roztok DPPH byl připraven v methanolu, poté 100mL roztoku DPPH a 100m1 1 syntetizovaných peptidů nebo GA byly smíchány v různých koncentracích ({{0}},1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM a 1mM) v 96-jamkových mikrotitračních destičkách. V orbitálním třepacím inkubátorusměsi reagovaly 30 minut při 37 °C C a 100 ot./min bezsvětlo. Poté byla měřena absorbance při 517 nm a byla vypočtena antioxidační kapacita.

2.4.2. Činnost čištění ROS.

Intracelulární aktivita vychytávání ROS byla hodnocena pomocí 20,{1}}dichlorfluorescein diacetátové soupravy(DCF-DA, Abcam, USA). Buňky HaCaT byly nasazeny na 96-jamkové mikrodestičky (5 103 buněk na jamku) a inkubovány při 37 C po dobu 24 hodin.Aftpo inkubaci byly kultury vystaveny syntetizovaným peptidům nebo GA (100mM) a inkubována při 37 C po dobu 24 hodin. Buňky byly poté vystaveny 10mM roztoku DCF-DA a inkubuje se 30 min. Aftpo inkubaci byl roztok promyt PBS. Thebuňky byly analyzovány pomocí čtečky mikrodestiček při excitaci a

emisní vlnové délky 485 nm a 530 nm.

Obr. 1Syntetický krok a potvrzení sekvence peptidů pomocí kvadrupólového časulet(Q-TOF) hmotnostní spektrometrie: (a) podrobný syntetický postup (b) TPPTTP, (c) galloyl–TPPTTP a (d) (galloyl)2–KTPPTTP.

2.5. Test potenciálu mitochondriální membrány

Pro mitochondrie bylo použito barvivo JC-1 (Thermo Fisher, USA).test membránového potenciálu (MmP). CCD-1064buňky Sk a HaCaT byly nasazeny na 96-jamkové mikrodestičky (5 10 3buněk na jamku)

a inkubováno ve 37 C a v 5 procentech CO2 po dobu 24 hodin. Na zádiinkubace,kultury byly vystaveny různým koncentracím syntetizovaných peptidů a inkubovány při 37 °C C v 5 procentech CO2 po dobu 24 hodin.Do buněk CCD-1064Sk a HaCaT bylo přidáno barvivo JC{0}}vyrábět a konečná koncentrace 10mM. Aftpo 10 minutách inkubace byly buňky dvakrát promyty 37 C PBS. Zelená a červenáfluorescencebyly měřeny pomocí Varioskan LUXMultimode Microplate Reader (ThermoFisher, USA) za excistanice (lPř)/emise (lEm) 475/530 nm a alPř/lEmz 475/590 nm, resp.

2.6. Test inhibiční aktivity elastázy

CCD-1064Buňky Sk byly nasazeny do 6-jamkových destiček a inkubovány při 37 C v 5 procentech CO2 po dobu 24 hodin. Kultury byly poté vystaveny koncentraci 100mM syntetizovaných peptidů nebo GA a inkubovány při 37 C v 5 procentech CO2 po dobu 24 hodin. Buňky byly dvakrát promyty dPBS a každou buňku jsme shromáždili pomocí buněčné škrabky. Aer přidání 0.2 M Tris–HCl (pH 8.0) s 0,1 procenta Tritonu-X ke shromážděnýmbuňky byly homogenizovány ultrazvukem. Homogenizovaný roztok byl centrifugován po dobu 20 minut při 3000 ot./mina 4 C. Poté, aftpo odběru supernatantu, množství proteinu-Kationt byl proveden pomocí BCA proteinového testu. Protein pro každéhovzorek byl vydán nafikonečná koncentrace 100mgmL 1, aN-sukcinyl-tri-alanyl-p-nitroanilid byl přidán dokonečná koncentrace 1,6 mM a reakce při 36 °C C po dobu 1 hodiny.Poté byla měřena absorbance při 405 nm pomocí čtečky mikrodestiček.

2.7. RT-qPCR

Hladiny mRNA markerů proti stárnutí v buňkách CCK-1064Skbyly hodnoceny pomocí RT-qPCR. Celková RNA byla shromážděna pomocí činidla TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA) a reverzně

přepsáno pomocí reagenční soupravy PrimeScript RT (Takara BioInc., Kusatsu, Japonsko). Systém CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) a iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Labora

tory) byly použity pro RT-qPCR.b-Aktin byl použit k normalizaci hladin mRNA kolagenu typu I, MMP-1 a PGC-1a. 

2.8. Statistická analýza

 Data jsou uvedena jako průměr standardní odchylka odtři nezávislá měření a analyzována pomocí Student'st-testy, sp < 0.05 considered to be a signinení rozdíl.

Požádat o víc:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950