Antifungální potenciál sekundárních metabolitů zapojených do interakce mezi citrusovými patogeny a Cistanche

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Citrusové plody mají významný dopad na světovou ekonomiku, protože mají největší produkci ve srovnání s jinými druhy ovoce; například celosvětová produkce pomerančů pro rok 2018/19 podle prognóz dosáhne 54,3 milionů tun. Hlavním faktorem ovlivňujícím kvalitu citrusů je posklizeňhoubová onemocnění,zejména zelená plíseň způsobená Penicillium digitatum, která je zodpovědná za 90 procent ztrát citrusů v období po sklizni1,3. Pro kontrolu posklizňových chorob se široce používají syntetické fungicidy, které způsobují zdravotní a ekologické problémy. Kromě toho si některé kmeny hub vyvinuly rezistenci vůči běžně používaným fungicidům. Tak jakoantimykotikumrezistence se stává významným problémem, hledání nových bioaktivních sloučenin hraje důležitou roli při obcházení rozsáhlého používání fungicidů7. Mikroorganismy jsou jedním z hlavních zdrojů přírodních produktů s užitečnými biologickými aktivitami, tj. potenciálemantimykotika, antibiotika, protirakovinná činidla, povrchově aktivní látky. Kromě genetického potenciálu a diverzity mikrobů však mnoho mikrobiálních biosyntetických genů není aktivováno v nepřirozených kultivačních podmínkách používaných v laboratoři a přístupných je pouze několik částí metabolitů10. Je implementováno několik strategií k překonání omezení v objevování přírodních produktů z mikrobiálních zdrojů, tj. přístup OSMAC10,11, použití epigenetických modifikací a kokultivace14. Ukázalo se, že společné kultury, které napodobují přírodní prostředí a vykazují mikrobiální soutěž o omezený prostor a živiny, jsou hlavní ekologickou silou, která by mohla aktivovat tiché shluky genů a obranné mechanismy, které mohou vést k produkci bioaktivních sekundárních metabolitů. 1 Chemický institut, University of Campinas, CP 6154, 13083-970, Campinas, SP, Brazílie. 2 Centrum přírodních a humanitních věd, Federal University of ABC, 09210-580, Santo André, SP, Brazílie. 3Katedra biomolekulární chemie, Leibnizův institut pro výzkum přírodních produktů a infekční biologii – Hans Knöll Institute, Jena, Německo. 4Chair of Natural Product Chemistry, Friedrich Schiller University Jena, 07743, Jena, Německo. relevantní pro umožnění nejen identifikace nových sloučenin, ale také pro zkoumání chemických jevů, které řídí interakce mezi mikroorganismy v přírodě. Dosud neexistují žádné informace o tom, jak houby citrusových patogenů interagují s jinými mikroorganismy ve stejném prostředí a jaké jsou mechanismy napadení a obrany proti endofytickým mikroorganismům nebo jiným fytopatogenům. Tyto informace mohou vést k objevu nových sekundárních metabolitů zapojených do mikrobiálních interakcí a poskytnout lepší znalosti o důležitosti mikrobiální ekologie během infekčního procesu. Zde ukazujeme interakci mezi Penicillium digitatum a Penicillium citrinum s cílem hledat novéantimykotikumsloučeniny, které by mohly být použity pro kontrolu posklizňových chorob. S ohledem na tento účel byla strategie společné kultivace a MSI použity k vyvolání produkce sekundárních metabolitů a poskytnutí počátečních poznatků o jejich biologické roli na základě jejich prostorové distribuce v interakci. Požadované metabolity byly izolovány a všechny struktury byly objasněny na základě hmotnostní spektrometrie a NMR experimentů. Dosud,antimykotikumbyly provedeny testy a analýzy konfokální mikroskopií s cílem prozkoumat potenciál metabolitů hub jako novýchantimykotikumagenti.

BYLINKOVÁ CISTANCHE

Materiály a metody

Kultura hub.Kmen P. digitatum (PD) použitý ve studiích je uložen ve španělské sbírce typových kultur (CECT) pod přístupovým kódem CECT20796. Kmen P. citrinum (PC) poskytlo Sylvio Moreira Citrus Center (Cordeirópolis, SP, Brazílie). P. digitatum a P. citrinum byly kultivovány na komerčním agaru s bramborovou dextrózou (PDA) (Acumedia). PDA byl autoklávován při 103 kPa (121 stupňů) po dobu 15 minut. PDA destičky byly skladovány při 25 stupních po dobu 7 dnů ve tmě. Spory byly sklizeny promytím povrchu agaru sterilní destilovanou vodou a naředěním na konečnou koncentraci 106 nebo 105 spor ml-1.

Společné kultivační podmínky pro růst plísní roztok spor (106 spor ml-1) byl naočkován na opačné strany. Destičky Te byly inkubovány ve tmě při 25 stupních po dobu 7 dnů.

Pro analýzy MSI a konfokální mikroskopii byla in vitro kokultura připravena umístěním sterilního mikroskopického sklíčka do Petriho misky, následovaným nalitím 11 ml PDA22 a nad podložním sklíčkem byla vytvořena inokula. Destičky byly inkubovány ve tmě při 25 stupních po dobu 72 hodin. Pro kokultivaci in vivo byly zralé pomeranče (Citrus sinensis) povrchově sterilizovány a poraněny23. Do místa rány byl naočkován malý kousek PDA obsahující P. citrinum. Infikované a kontrolní pomeranče byly skladovány ve sterilních 500ml kádinkách ve tmě při 25 stupních. Po 10 dnech byly plody poraněny na opačné ekvatoriální oblasti inokula P. citrinum a infikovány roztokem P. digitatum 106 spor ml-1. Plody byly skladovány déle než 5 dní ve tmě při 25 stupních.

Mass Spectrometry Imaging (MSI) analýza a generování MS obrazu.

Po inkubační době byla mikroskopická sklíčka vyjmuta z Petriho misek a vložena do vakuového exsikátoru na 1 hodinu, aby došlo k úplné dehydrataci agaru (Angolini et al., 20}15). Analýzy MSI byly provedeny přímo na mikroskopu obsahujícím kokulturu v pozitivním režimu s použitím desorpčního elektrosprejového ionizačního zdroje (DESI) Prosolia Model Omni Spray 2D®-3201) spojeného s Thermo Scientific QExactive® Hybrid Quadrupole-Orbitrap Hmotnostní spektrometr. Data MSI byla získána s hmotnostní rozlišovací schopností 70.000 při m/z 200. Použitá konfigurace DESI byla stejná jako v předchozí práci22. Snímky byly generovány s šířkou přihrádky Δm/z=± 0,07 pomocí softwaru pro konverzi dat Firefly (verze 2.1.05) a zpracovány pomocí softwaru BioMap (verze 3.8.0.4) vyvinutého společností Novartis Institutes for BioMedical Research. V BioMap bylo barevné škálování upraveno na pevnou hodnotu během zpracování každého obrázku. MS spektra byla zpracována softwarem Xcalibur (verze 3.0.63) vyvinutým společností Thermo Fisher Scientific.

Extrakce metabolitů z experimentů společné kultury.

Celý obsah společné kultury in vitro byl nakrájen na malé kousky a přenesen do Erlenmeyerovy baňky. Extrakce byla provedena za použití methanolu. Baňky byly sonikovány po dobu 1 hodiny v ultrazvukové lázni a vakuově filtrovány. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku a konečný extrakt byl skladován při -20 °C.

Pro in vivo kokultivaci byly pomerančové slupky nařezány (2 cm x 2 cm) v zóně rozhraní mezi mikroorganismy a byla provedena extrakce 5 ml methanolu po dobu 1 hodiny v ultrazvukové lázni. Extrakty byly filtrovány, sušeny pod N2 a skladovány při -20 °C.

Analýza hmotnostní spektrometrií (MS).

Extrakty byly zředěny v methanolu a analyzovány na hmotnostním spektrometru Thermo Scientific QExactive® Hybrid Quadrupole-Orbitrap. Analýzy byly provedeny v pozitivním režimu s rozsahem m/z 115–1500, kapilární napětí 3,4 kV, teplota vstupní kapiláry 280 stupňů, S-čočka 100V. Bylo injikováno 5 ul vzorku. Stacionární fáze: Termo Scientific kolona Accucore C18 2,6 µm (2,1 mm × 100 mm). Mobilní fáze: 0,1% kyselina mravenčí (A) a acetonitril (B). Eluentní profil (A/B): 95/5 až 2/98 během 15 minut, výdrž 5 minut, až 95/5 během 1,2 minuty a udržení 7,8 minuty. Celková doba běhu byla 29 minut pro každý běh a průtok byl 0,2 ml/min. Objem nástřiku: 5 µL.MS/MS byl proveden kolizí indukovanou disociací (CID) s rozsahem m/z 100–800 a srážková energie se pohybovala od 10 do 50 V. Vzorky byly přímo infundovány elektrosprejem s průtokem 5,0 ul min-1. MS a MS/MS data byla zpracována softwarem Xcalibur (verze 3.0.63) vyvinutým Thermo Fisher Scientific.

VÝHODA DOPLNĚK CISTANCHE: ZLEPŠENÍ IMUNITY

Separace metabolitů (HPLC analýza).

Separace sekundárních metabolitů byly dosaženy pomocí Phenomenex kolony Luna 5µm Phenyl-Hexyl (25{{10}}×4,6 mm) a SHIMADZU prominence HPLC LC-20AT, vybavené CBM{{6} }modul komunikační sběrnice, detektor fotodiodového pole SPD-M20A a automatický vzorkovač SIL-20. Mobilní fáze: voda (0,1% kyselina mravenčí) (A) a acetonitril (B). Profil eluentu (A/B): 65/35 až 50/50 během 50 minut, až 40/60 během 20 minut. Celková doba běhu byla 70 min a průtok 1,0 ml/min. Objem injekce byl 5 ul. Preparativní HPLC čištění bylo provedeno na koloně Phenomenex Luna 5 um Phenyl-Hexyl (250 x 10 mm) za použití Waters 1525 Binary HPLC Pump vybavené Waters 2998 Photodiode Array Detector a Waters Fraction Collector III za použití stejných optimalizovaných podmínek gradientu. Průtok byl nastaven na 4,7 ml/min-1 a vstřikovaný objem byl 200 ul.

NMR spektroskopie.

1H NMR, 13C NMR a 2D experimenty byly prováděny na Bruker Avance III 500 (1H 500,13 MHz a 13C 125,7 MHz) a Bruker Avance III 600 (1H 600,17 MHz). Jako rozpouštědlo a vnitřní reference byly použity deuterovaný chloroform (CDCI3; 7,23 ppm), dimethylsulfoxid (DMSO; 2,50 ppm a 39,51 ppm) a tetramethylsilan (TMS; 0,0 ppm). Chemické posuny (5) byly vyjádřeny v (ppm) a vazebné konstanty (J) v Hertzech (Hz).

Analýza molekulárních sítí.

Molekulární síť pro metabolity P. citrinum byla vytvořena pomocí online pracovního postupu na Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) (http://gnps.ucsd.edu). Data byla filtrována odstraněním všech píku MS/MS v rozmezí plus /-17 Da prekurzoru m/z. MS/MS spektra byla filtrována oknem výběrem pouze 6 nejlepších píků v okně plus /-50Da v celém spektru. Data byla poté shlukována pomocí MS-Cluster s rodičovskou hmotnostní tolerancí 0,2 Da a MS/MS fragmentovou iontovou tolerancí 0,2 Da pro vytvoření konsenzuálních spekter. Dále byla vyřazena konsensuální spektra, která obsahovala méně než 2 spektra. Poté byla vytvořena síť, kde byly hrany filtrovány tak, aby měly cosinusové skóre nad 0,65 a více než 2 odpovídající vrcholy. Další hrany mezi dvěma uzly byly v síti zachovány pouze v případě, že se každý z uzlů objevil v příslušných top 10 nejpodobnějších uzlů. Spektra v síti byla poté prohledána proti spektrálním knihovnám GNPS. Spektra knihovny byla filtrována stejným způsobem jako vstupní data. Všechny shody mezi spektry sítě a spektry knihovny musely mít skóre nad 0,5 a alespoň 5 shodných píku.

Antifungální testy.

Zásobní roztok extraktu společné kultury byl připraven v methanolu a dále zředěn v PDA na koncentraci 0,5 mgmL-1. 15 ml výsledného roztoku bylo nalito do Petriho misky a následně naočkováno 15 ul roztoku P. digitatum o objemu 105 ml-1 sporů na střed agarové plotny. Byl také proveden kontrolní test. Destičky byly inkubovány ve tmě při 25 stupních po dobu 96 hodin. ProantimykotikumV testech bylo 2,5 ml PDA doplněno 6, 9 a 10 (400 ugmL-1) a každý roztok byl nalit do 6-jamkové mikrodestičky. 5 ul 105 ml-1 sporového roztoku P. digitatum bylo naočkováno do středu každé agarové plotny. Negativní kontroly byly provedeny třikrát. Mikrodestička byla inkubována ve tmě při 25 stupních po dobu 96 hodin. Pro stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) sloučenin 1 a 4 byl proveden test ředění mikrobujónu podle doporučení Clinical and Laboratory Standards Institute (2008)24 s několika úpravami. Zásobní roztoky 1 a 4 byly připraveny ve vodě (5% methanol) a dále naředěny v médiu YES v rozmezí koncentrací do 600 µg ml-1 až 1 µg ml-1. 195 ul každého roztoku bylo přeneseno na 96-jamkovou mikrodestičku a následně bylo naočkováno 5 ul roztoku P. digitatum o objemu 105 ml-1 spor. Testy byly provedeny v duplikátech a kontroly v triplikátech. Jako pozitivní kontrola byl použit itrakonazol (100 ugml-1). Negativní kontroly byly provedeny s methanolem v ANO. Mikrodestičky byly inkubovány ve tmě při 25 stupních po dobu 96 hodin.

Konfokální laserová skenovací mikroskopie.

Po inkubační době byla mikroskopická sklíčka vyjmuta z Petriho misky. Vzorky kokultury in vitro byly obarveny konžskou červení (0,25 procent w/v ve vodě) po dobu 20 minut a krátce promyty v destilované vodě. Vzorky byly analyzovány mikroskopem Leica TCS SP5. Excitace byla prováděna 543nm emisní linií He-Ne laseru a bylo shromažďováno světlo emitované mezi 570 a 680nm.

VÝHODACISTANCHE: ZLEPŠENÍ IMUNITY

Výsledky a diskuse

MSI odhaluje potenciální antimykotika v interakci mezi P. digitatum a P. citrinum.

Chcete-li zobrazit novéantimykotikumsloučenin s potenciálem chránit citrusové plody a kontrolovat posklizňové choroby, použili jsme strategii společné kultivace zahrnující P. digitatum a další citrusový patogen, P. citrinum. Kokultivace je strategie inspirovaná přírodou, ve které může konkurence mezi mikroorganismy vyvolat produkci nových metabolitů. V předchozí práci kokultivace mezi Trichophyton rubrum a Bionectria ochroleuca indukovala produkci nového sulfatovaného analogu PS-990, což naznačuje, že tato sloučenina je dále sulfatována během houbové interakce26. Dalším příkladem sloučeniny odvozené z interakce hub je izolovaný tetrapeptid cyklo-(L-leucyl-trans-4-hydroxy-L-prolyl-D-leucyl-trans-4-hydroxy-L-prolin). z kokultivačního bujónu Phomopsis sp. K38 a Alternaria sp. E33; cyklický tetrapeptid vykazoval střední až vysokou inhibiční aktivitu proti fytopatogenním houbám ve srovnání s komerčním fungicidem triadimefonem27. Kokultivační experimenty jsou tedy životaschopným přístupem k nalezení sloučenin, které mohou inhibovat hlavní citrusové fytopatogeny, zejména zelenou plíseň způsobenou P. digitatum.

Při kokultivaci provedené v oranžovém (in vivo) i syntetickém médiu (in vitro) jsme vizuálně pozorovali inhibici růstu na velkou vzdálenost mezi P. citrinum a P. digitatum. Při interakci hub mohou být aktivovány tiché geny a škodlivé metabolity mohou být zneškodněny z jednoho partnera na druhého16,28. Metabolity indukované Tese jsou obvykle lokalizovány v zóně konfrontace v pevných médiích společných kultur16. Běžné přístupy používané k detekci a objasnění metabolitů, jako je hmotnostní spektrometrie spojená s kapalinovou (LC-MS) nebo plynovou (GC-MS) chromatografií, však neposkytují informace o prostorovém rozložení molekul.

Informace o molekulární prostorové distribuci lze získat zobrazením hmotnostní spektrometrie (MSI), výkonným nástrojem, který generuje obrazy pro každý ion detekovaný v hmotnostním spektru16. Použití MSI k pochopení mikrobiálních systémů a jejich sekundárních metabolitů není nové a studie, kde byla tato technika úspěšně aplikována, lze nalézt v literatuře30. Například MSI byla použita ke zkoumání interakce mezi Bacillus subtilis 3610 a Streptomyces coelicolor A3. DESI zobrazení bakteriální společné kultury odhalilo 57 signálů prostorově lokalizovaných do bakteriálních kolonií, což vedlo k identifikaci některých sekundárních metabolitů, jako je surfaktin a plipastatin31. Kromě toho analýza MSI také ukázala, že S. coelicolor má produkci určitých sekundárních metabolitů inhibovanou v přítomnosti B. subtilis, což odhalilo interakci mezi bakteriemi31.

Proto, abychom detekovali sekundární metabolity zapojené do interakce mezi citrusovými patogeny, aplikovali jsme DESI-MSI přímo na povrch kokultivačního agaru, abychom vizualizovali difúzi sloučenin do zóny konfrontace. Signály MSI byly získány pro ionty [M plus H] plus při m/z 519,1857, m/z 503,1908, m/z 475,1590, m/z 460,1960, m/z 459,1645, m/z 62985,39 m/z. z 527,2862, m/z 511,2894 a m/z 448,2938 (obr. S1–S10). Pozorovali jsme, že všechny zmíněné ionty byly detekovány a koncentrovány v zóně konfrontace mezi houbami (obr. 1). Tyto sloučeniny mohou souviset s interakcí houba-houba a mohly by být potenciálně novými antimikrobiálními činidly. Ionty s m/z 625, 609, 527, 511 a 448 byly produkovány P. citrinum, zatímco ionty s m/z 519, 503, 475, 460 a 459 se zdály být protiútokem P. digitatum. , odhalující chemickou válku mezi těmito dvěma citrusovými patogeny. Te ionty detekované in vitro pomocí MSI analýz byly také detekovány v extraktech kokultur in vivo (obr. S11–S20) s použitím pomerančů jako substrátu (obr. 2).

Aby se charakterizovaly metabolity zapojené do interakce, extrakt z kokultury byl získán z experimentu se zvětšenou kultivací a sledované sloučeniny, původně detekované pomocí MSI analýz, byly izolovány preparativní HPLC a charakterizovány pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie a NMR analýz.

Prostřednictvím přesných hmotností získaných pomocí DESI-MSI analýz (tabulka 1) bylo možné potvrdit přítomnost indolových alkaloidů produkovaných P. digitatum. Ionty [M plus H] plus při m/z 519,1857, m/z 503,1908, m/z 475,1590, m/z 460,1960 a m/z 459,1645, které odpovídají tryptoquialanin A (1), tryptoquialanin (1), tryptoquialanin (tryptoquilaqui) 3), 15-dimethyl-2-epi-fumichinazolin A (4) a deoxytryptochialanon (5) (chemické struktury znázorněné na obr. 3). Tyto sloučeniny jsou součástí biosyntetické dráhy tryptochialaninů32 a byly dříve detekovány během DESI-MSI analýzy pomerančů infikovaných chorobou zelené plísně23. Sloučenina 1 byla hlášena jako hlavní sekundární metabolit produkovaný P. digitatum33. Delece tohoto genu, odpovědného za regulaci biosyntézy 1, však ukázala, že 1 se nepodílí na patogenitě P. digitatum proti citrusům, protože infekční schopnost mutantů nebyla změněna34. Přesná biologická úloha tryptochialaninů je stále neznámá34 a tato studie poskytuje novou biologickou aktivitu tryptochialaninů se zapojením těchto alkaloidů do interakce hub. MS/MS iontu [M plus H] plus při m/z 625,3951 poskytlo fragmenty při m/z 594,3533, 576,3427, 449,2430 a 431,2325 (obr. S21), stejný vzor fragmentace získaný pro citrinin A (6 ve studii zahrnující kokultivaci mezi P. citrinum a Pseudoalteromonas sp. OT5919. Také databáze GNPS naznačovala, že iontem při m/z 625 by mohl být citrinin A. Tandemové hmotnostní spektrum získané pro tuto sloučeninu sdílelo pět společných fragmentů s tandemovým hmotnostním spektrem 6 uloženým v databázi (obr. S22). Kromě toho sdílí podobný vzorec fragmentace MS/MS s citrininem A, který uvádí Moree et al. (2014). Citrinadiny byly hlášeny, že jsou více produkovány v situacích společné kultury a koncentrovány v rozhraních společné kultury, což naznačuje obrannou reakci P. citrinum proti jiným mikroorganismům Analýza molekulárních sítí izolovaných sloučenin odhalila, že do společné kultury je zapojen další citrinin interakce. Pozorovali jsme, že iont na m/z 609, detekovaný původně analýzou MSI, je seskupen ve stejném shluku sloučeniny 6 (m/z 625) (obr. S23), což naznačuje, že tato sloučenina je metabolit podobný citrininu. V analýze molekulární sítě jsou příbuzné metabolity seskupeny do stejných shluků, protože mají podobné MS/MS spektrum.

Přesná hmotnost získaná pro ion [M plus H] plus při m/z 609,4010 odpovídá sloučenině s molekulovým vzorcem C35H53N4O5. Vzor fragmentace poskytl fragmenty při m/z 578,3583, 464,2905, 451,2586 a 433,2482 (doplňkový obrázek S24). 'H NMR a 1H-1H COZY spektra získaná pro purifikovaný metabolit (obr. S25–S26 a tabulka S1) vykazovala podobné signály syntetizovaného deoxycitrinadinu A, které popsal Bian et al. (2013)37. Charakteristický signál epoxidu při 8H 4,0 v tomto derivátu chyběl a signál pro vynilový vodík mohl být pozorován při 5H 6,9, což ukazuje na nepřítomnost epoxidové skupiny a přítomnost dvojné vazby ve srovnání s citrininem A37. Je to poprvé, co je deoxycitrinadin A (7) v literatuře uváděn jako sekundární metabolit produkovaný mikroorganismem.

Přesné hmotnosti získané pomocí DESI-MSI pro ionty [M plus H] plus při m/z 527,2862 a 511,2894 indikovaly sloučeniny s elementárním složením C28H38N4O6, respektive C28H38N4O5. MS/MS odhalilo, že iont při m/z 511 má podobnou strukturu ve srovnání s m/z 527, s výjimkou nepřítomnosti atomu kyslíku. Fragmentace iontu při m/z 527 poskytla fragmenty m/z 281, 247, 219, 182 a 120 (obr. S27), zatímco iont při m/z 511 poskytla m/z 265, 247, 219, 166 a 120 (obr. S30). Stejný vzor fragmentace byl popsán pro sekvenci tetrapeptidů Phe-Val-Val-Tyr (8) z Penicillium canescens. Přesto byly tetrapeptidy 8 a Phe-Val-Val-Phe (9) nedávno hlášeny jako sekundární metabolity produkované Penicillium roqueforti. 1H a 13C NMR analýzy izolovaných sloučenin (obr. S28–S32 a tabulky S2-S3) potvrdily výsledky získané pomocí MS/MS se závěrem, že ionty při m/z 527 a m/z 511 odpovídají 8 a 9, v tomto pořadí. Produkce těchto tetrapeptidů v fungální chemické válce není překvapivá, protože malé peptidy jsou známé svou antimikrobiální aktivitou40. Toto je první zpráva o 8 a 9 jako sekundárních metabolitech P. citrinum. Pro iont [M plus H] plus při m/z 448,2938 přesná hmotnost naznačovala sloučeninu s molekulovým vzorcem C28H38N3O2, stejné složení jako sekundární metabolit chrysogenamid A (10) (chyba=-4,6 ppm). Sloučenina 10 byla izolována a1H a 13C NMR analýzy (obr. S33–S34 a tabulka S4) potvrdily její strukturu; je to první zpráva, že se chrysogenamid A účastní houbové interakce. Sloučenina 10 byla poprvé popsána jako sekundární metabolit Penicillium chrysogenum č. 005, endofytické houby spojené s rostlinouCistanche deserticola. Také 10 byl popsán jako sekundární metabolit kmene P. citrinum42. Struktury metabolitů produkovaných P. citrinum jsou znázorněny na obr. 4. Obr.

Antifungální testy.

Prozkoumali jsmeantimykotikumAktivita metabolitů produkovaných ve společné kultuře a P. digitatum byla naočkována do agarového média obsahujícího extrakt ze společné kultury. Ve srovnání s kontrolou jsme pozorovali snížení radiálního růstu P. digitatum o 67 procent (obr. S35), což naznačuje, že metabolity zapojené do boje proti houbám mají potenciál jako antimykotika. Abychom tuto hypotézu potvrdili, testovali jsme izolované sloučeniny a pozorovali jsme, že sloučeniny 6, 9 a 10 (400 µg ml-1) snížily radiální růst P. digitatum o 48 procent, 41 procent a 61 procent ve srovnání s kontrolou. (obr. 5), což potvrzuje antifungální aktivitu. Bylo zjištěno, že citrinadiny se podílejí na reakci P. citrinum proti jiným mikroorganismům v kokulturách, ale jejich biologická role v biologickém prostředí je dodnes neznámá19. Sloučenina 6 byla testována na aktivitu vředů proti Buruli na Mycobacterium ulcerans MN209, ale nebyla pozorována žádná zajímavá MIC43; také byla hlášena cytotoxická aktivita 6 proti buňkám leukémie a karcinomu44. Naše výsledky jsou první zprávou o antimikrobiální aktivitě citrinadinů v literatuře a mohou poskytnout první pohled na biologickou roli těchto sloučenin v interakcích mezi houbami a houbami. Navíc chrysogenamid A nebyl dosud nikdy hlášen jako antimikrobiální látka. Sloučenina 10 vykazovala ochranný účinek na neurocyty proti buněčné smrti vyvolané oxidativním stresem41, avšak žádná jiná biologická aktivita pro 10 nebyla v literatuře popsána. Antifungální testy používající D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr odhalily, že tento tetrapeptid má inhibiční aktivitu proti B. titulky a fytopatogenu sóji Fusarium virguliforme38. Naproti tomu žádná inhibice E. coli, B. subtilis a S. cerevisiae v přítomnosti D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr nebo D-Phe-L-Val-D-Val-L -Phe byl pozorován39. Byla také hodnocena antifungální aktivita tryptochialaninů, protože se zdálo, že tyto sloučeniny jsou chemickou reakcí P. digitatum proti P. citrinum v chemickém boji. Tryptochialaniny 1 a 4 byly testovány a odhalily antifungální aktivitu proti P. citrinum. Sloučeniny 1 a 4 měly MIC 300 ugml-1, což inhibovalo produkci spór P. citrinum (obr. S36). Podle našich nejlepších znalostí je to první zpráva o antimikrobiální aktivitě tryptochialaninů. Nedávno byla prokázána sloučenina 1 jako insekticidní sloučenina proti Ae. aegypti larvae23; antifungální aktivita může poskytnout lepší pochopení úlohy tryptochialaninů v prostředí citrusových patogenů, jakmile tyto sloučeniny nejsou vyžadovány pro virulenci P. digitatum.

VÝHODACISTANCHE: Antibakteriální

Chemická válka mění buněčnou stěnu P. digitatum ve společné kultuře.

Prozkoumat působení sekundárních metabolitů běhemhoubovýInterakce byly vzorky kokultury obarveny konžskou červení a pozorovány pomocí konfokální laserové skenovací mikroskopie. Kongo červeň se běžně používá k barvení polysacharidů obsahujících 1,4 vazby, jako je např.houbovýsložka buněčné stěny chitin45,46. Hyfy P. digitatum byly pozorovány v zóně konfrontace (vzorek) a porovnány s hyfami vzdálenými od oblasti rozhraní (kontrola) (obr. S37). Kontrolní hyfy byly homogenně obarveny konžskou červení, zatímco hyfy v oblasti rozhraní vykazovaly změněný vzor barvení (obr. 6) s nepravidelnými skvrnami. Podobné vzorce barvení byly získány pro knockout mutantní houby, ve kterých měly deletované geny roli v organizaci buněčné stěny; v důsledku toho mutanty vykazovaly defektní buněčné stěny a nepravidelné barvení25,46,47. Abnormální barvení Calcofluor White však bylo pozorováno u P. ostreatus P89 ošetřených 36°; vysoká teplota změněná distribuce chitinu a integrita buněčné stěny48. Tato data ukazují, že hyphae P. digitatum, v kontaktu s metabolity difundovanými během společné kultivace, mají defektní buněčnou stěnu, protože se konžská červeň váže na struktury buněčné stěny hub. Buněčná stěna hub je atraktivním cílem antimikrobiálních látek, protože nejsou přítomny v savčích buňkách49,50. Závěrem lze říci, že mikroskopická analýza a antifungální testy potvrzují, že metabolity zapojené do interakce s houbami mají potenciál jakoantimykotikuma může být přirozeným mechanismem, který tyto fytopatogeny vyvinuly, aby soutěžily s jinými mikroorganismy o hostitele (obr. 7).

Závěry

Hledání nových přírodních antimikrobiálních látek je slibnou oblastí ve výzkumu přírodních produktů týkající se ekonomického dopadu posklizňových chorob na celosvětové zemědělství. Kromě toho, výskyt kmenů hub odolných vůči fungicidům přináší objev novéhoantimykotikummimořádně důležité látky nahrazující syntetické sloučeniny. Pomocí kokultivace mezi fytopatogeny, které soutěží o stejného hostitele, P. digitatum a P. citrinum, jsme pozorovali houbovou interakci. Pomocí techniky MSI jsme detekovali sekundární metabolity defundované do zóny rozhraní mezi mikroorganismy. Tryptochialaniny, citrinadiny, chyrsogenamid A a tetrapeptidy vykazovaly velkou antifungální aktivitu, což potvrzuje, že kokultury a technika MSI jsou dobrou kombinací při hledání nových přírodních antimikrobiálních látek.

Do tohoto data nebyly žádné informace o interakci mezi citrusovými patogenními houbami. Naše data odhalila sloučeniny, které hrají roli v mikrobiální ekologii citrusů. Kromě toho jsme prokázali, že studované metabolity mají velký potenciálantimykotikumagens, protože buněčné stěny hub jsou jedním z hlavních cílůantimykotikumsloučeniny. Použití identifikovaných sloučenin jako přírodních antimykotik namísto syntetických fungicidů by mělo být dále prozkoumáno. Tento článek otevírá nové možnosti výzkumu a přispívá k ochraně životního prostředí a lidského zdraví tím, že pomáhá při hledání bezpečnějších strategií pro zemědělství pomocí sloučenin získaných z přírodních zdrojů.

VÝHODADOPLNĚK CISTANCHE: ZLEPŠENÍ IMUNITY