Anti-tyrosinázové vlastnosti různých druhů kurkumy a izolace aktivních látek z Curcuma Amada

Jesmin Akter1 ● Md. Zahorul Islam1,2 ● Md. Amzad Hossain1 ● Kensaku Takara1

1 Zemědělská fakulta, University of the Ryukyus, Okinawa, Japonsko

2 Ústav farmakologie, Fakulta veterinární, Bangladéšská zemědělská univerzita, Mymensingh, Bangladéš

Pro více informací:Scotty.Wang@wecistanche.com

Abstraktní

Kurkuma se tradičně používá jako kosmetika na kůži při některých náboženských a kulturních příležitostech na indickém subkontinentu. V této studii jsme porovnávali tyrosinázové inhibiční vlastnosti čtyř Curcuma spp., jmenovitě C. xanthorrhiza, C. aromatické, C. amada a C. zedoaria. Biotestem řízená izolace a čištění inhibitorů tyrosinázy pomocí silikagelové kolony a vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Strukturní identifikace sloučenin byla provedena za použití1H NMR, 13C

NMR a kapalinová chromatografie-tandemová hmotnostní spektrometrie. C. amada vykazovala nejvyšší inhibiční aktivitu tyrosinázy s IC50 53,4 ug/ml. Proto byl vybrán pro izolaci a čištění inhibitorů tyrosinázy. Purifikovanými sloučeninami byly zederon (1), furanodienon (2), 1,5-epoxy-3-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy-5-methoxyfenyl){ {13}}(4-hydroxyfenyl)heptany (3), 3,5-dihydroxy-1-(3,4-dihydroxyfenyl)-7-({{22 }}hydroxy-3-methoxyfenyl)heptany (4) a 1,5-epoxy3-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy-5-methoxyfenyl) -7-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)heptany (5). Hodnoty IC50 pro houbuanti-tyrosinázaaktivita sloučenin 1, 2, 3, 4 a 5 byla 108,2, 89,2, 92,3, 21,7 a 41,3 uM, v daném pořadí. Tyto sloučeniny také inhibovaly intracelulární aktivitu tyrosinázy, a tak snižovaly syntézu melaninu v melanomových buňkách B16F10. Sloučenina 4 byla výrazně silnějšíanti-tyrosinázaaktivitu než arbutin (lék pro pozitivní kontrolu). Nebyl pozorován žádný významný rozdíl v inhibičním účinku tyrosinázy mezi sloučeninou 5 a arbutinem. Naše zjištění silně naznačují, že C. Amanda je slibným zdrojem přírodních inhibitorů tyrosinázy k prevenci melanogeneze a mohla by být použita jako bělící kosmetika.

Klíčové slovo: Curcuma amada ● Aktivní látky ● NMR ● Anti-tyrosináza ● Antimelanogenní

Clízat do Cistanche pro anti-tyrosinázu

Úvod

Melanin je černý pigment ve vlasech a pokožce a je nezbytný pro ochranu pokožky před UV zářením. Pigment je produkován buňkami melanocytů přítomnými v bazální vrstvě dermis prostřednictvím fyziologického procesu zvaného melanogeneze. Abnormální produkce melaninu však způsobuje dermatologické poruchy, jako jsou pihy, melasma, lentiginy, stařecké skvrny, efelidy a pozánětlivé hyperpigmentace [1]. V potravinářském průmyslu vede hyperpigmentace ovoce a zeleniny k významným ztrátám nutriční kvality a tržní hodnoty [2]. Melanogenezi lze kontrolovat inhibicí aktivity tyrosinázy, enzymu omezujícího rychlost syntézy melaninu u savců, rostlin, mikroorganismů a hub [3]. Proto inhibice aktivity tyrosinázy zabraňuje hyperpigmentaci a vede k bělení kůže. Kontroluje také kvalitu zeleniny a ovoce tím, že reguluje nežádoucí hnědnutí zeleniny a potravin. Většina činidel zesvětlujících pokožku, jako je hydrochinon, kyselina azelaová, kyselina kojová a arbutin, jsou silnými inhibitory tyrosinázy. Mají však různé nežádoucí účinky, jako je cytotoxicita, ochronóza, vitiligo, podráždění, olupování kůže a zarudnutí [4]. Kromě toho kyselina kojová a -arbutin vykazují špatnou stabilitu formulace a schopnost penetrace kůží a nízkou účinnost in vivo [5]. Některé organické a anorganické soli rtuti mají antimelanogenní účinky a používají se v prostředcích na bělení kůže. Prostřednictvím kožní absorpce však mohou sloučeniny rtuti způsobit toxické účinky, jako je změna barvy kůže, poškození ledvin, alergické reakce a zjizvení [6]. Je tedy zapotřebí výzkum méně toxických a účinnějších inhibitorů tyrosinázy. Kurkuma (čeleď: Zingiberaceae; rod: Curcuma), tradiční léčivá rostlina, která roste převážně v tropických a subtropických oblastech Asie a Afriky, má široké spektrum farmakologických funkcí. Tradičně se používá v předmanželských rituálech po tisíce let na indickém subkontinentu jako prostředek pro zesvětlení pokožky. Předpokládá se, že kurkuma zlepšuje pleť tím, že snižuje růst chloupků na obličeji, akné a stárnutí pokožky [7, 8]. Proto jsou na trhu komerčně dostupné produkty péče o pleť doplněné kurkumou [9]. Bylo identifikováno více než 70 druhů/odrůd kurkumy s různými chemickými a farmakologickými vlastnostmi. Existuje však nedostatek vědeckých informací o antimelanogenních vlastnostech různých druhů kurkumy a potenciálních aktivních složkách přítomných v kurkumě. Kurkuminoidy jsou hlavní aktivní sloučeniny zodpovědné za většinu biologických aktivit kurkumy. Kurkuminoidy mají potenciál v kosmeceutikách jako anantioxidant, protizánětlivé,a činidlo zesvětlující pokožku [7, 8]. V předchozí studii jsme však zjistili významné rozdíly v obsahu kurkuminoidů v kurkumě a některé druhy (C. amada, C. zedoaria) dokonce kurkumin neobsahovaly [10]. Hlásili jsme také antimykotikum,antioxidanta vazodilatační aktivity různých druhů a odrůd kurkumy [10–13]. Cílem této studie bylo zhodnotit účinky různých druhů kurkumy, jmenovitě C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada a C. zedoaria, na enzym tyrosinázu a identifikovat specifické chemické sloučeniny odpovědné zaanti-tyrosinázaaktivita. Také jsme hodnotili tyrosinázovou inhibiční aktivitu a antimelanogenní účinky purifikovaných aktivních sloučenin na syntézu melaninu v melanomových buňkách B16F10.

Výsledky a diskuse

Mezi čtyřmi různými druhy kurkumy vykazoval MeOH extrakt C. amada maximální inhibiční účinek na tyrosinázu hub s hodnotou IC50 53,4 ± 2,7, následovaný C. xanthorrhiza, C. aromatická a C. zedoaria (obr. 1a). Kurkumin je hlavní aktivní složkou kurkumy (Curcuma longa) a má širokou škálu biologických aktivit, včetně protirakovinných, protizánětlivých, antibakteriálních, protiplísňových a antioxidačních aktivit. Vykázala 75-násobně silnější antityrosinázovou aktivitu než arbutin a kyselina kojová [14]. V předchozí studii jsme však uvedli, že existují významné rozdíly v obsahu kurkuminu u různých druhů kurkumy [10].

Kurkumin byl přítomen v C. xanthorrhiza a C. aromatické, ale chyběl v C. zedoaria a C. amada [10]. Zajímavými zjištěními této studie je, že bez kurkuminu vykazovala C. amada silnou inhibiční aktivitu vůči tyrosináze. Tento výsledek ukazuje, že musí existovat některé aktivní sloučeniny C. amada přisuzované jeho silnému anti-tyrosinázovému účinku. Antityrosinázová aktivita C. xanthorrhiza a C. aromatica může být způsobena jejich obsahem kurkuminu. Nemohli jsme však vyloučit možnost přítomnosti dalších sloučenin. MeOH extrakt z C. amada byl frakcionován vodou, n-hexanem a EtOAc. Mezi těmito třemi frakcemi vykazoval EtOAc významně silnější inhibiční účinek než voda a n-hexan (obr. 1b). Proto byla EtOAc část odebrána pro další frakcionaci. Anti-tyrosinázové aktivity šesti frakcí [n-hexan:EtOAc; 100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) a 0:100 (F6)] z EtOAc části C. amada byly porovnány. Mezi těmito šesti frakcemi F6 a F3 vykazovaly významně vyšší anti-tyrosinázovou aktivitu než ostatní (obr. 1c). Poté byly identifikovány chemické struktury pěti sloučenin z frakcí F3 a F6 podle jejich 'H NMR a 13C NMR spekter. Špičkové údaje byly následující:

sloučenina 1:

Bezbarvý krystal ve tvaru jehly; UV Amax: nm 234, 285. ESI-MS (plus) m/z: 247,3 [M plus H] plus, 229,4 [M plus H-H20] plus. 'H-NMR (CD3OD): 5 7,22 (1H, s, H-12), 5,59 (1H, br d, J=12 Hz, H{{20}}) , 3,99 (1H, s, H-5), 3,85 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3,69 (1H, d, J=16 Hz, H-9b), 2,57 (1H, dddd, J=13, 13, 12, 4 Hz, H-2a), 2,26 (1H, m, H{{46} }}a), 2,2 0 (1H, m, H{{50}}b), 2,09 (3H, s, H-13), 1,57 (3H, s, H-15), 1,32 (1H, ddd, J=13, 13, 4 Hz, H-3b), 1,28 (3H, s, H-14). 13C-NMR (CD3OD): 5 194,2(C-6) 160,2(C-8), 139,7(C12), 132,8 (C-1), 132,0(C-10 ), 124,3(C-11), 123,0(C-7), 67,8(C-5), 65,2(C-4), 42,5(C-9 ), 39,0(C-3), 25,4(C-2), 15,7 (C-15), 15,4(C-14), 10,7(C-13 ) (Doplňkové údaje). Ze srovnání těchto údajů s údaji uváděnými v literatuře [15, 16] byla látka identifikována jako zederon (obr. 2). Jedná se o seskviterpen, který byl dříve izolován z C. amada a C. zedoaria a byl popsán pro své analgetické, protizánětlivé, protiplísňové a cytotoxické účinky [12, 17–20].

sloučenina 2:

Bezbarvý olej; UV λmax: nm 243, 280. ESIMS (plus) m/z: 231.{83}} [M plus H] plus, 223,3 [M plus H-H20] plus. 'H-NMR (CD3OD): 5 7,16 (1H, s, H-12), 5,83 (1H, s, H-5), 5,21 (1H, dd, J=12 Hz , 5 Hz, H-1), 3,73 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3,63 (1H, d, J=16 Hz, H -9b), 2,45 (1H, ddd, J=15 Hz, 11 Hz, 4 Hz, H-3a), 2,31 (1H, m, H-2a ), 2,2 0 (1H, dddd, J=12 Hz, 12 Hz, 12 Hz, 4 Hz, H-2b), 2,06 (3H, s, H{{57} }), 1,92 (3H, s, H-14), 1,89 (1H, m, H-3b), 1,25 (3H, s, H-15). 13C-NMR (CD3OD): 5 191,8 (C-6), 158,6 (C-8), 147,6 (C-4), 140,0 (C-12), 136,1 ( C-10), 133,3 (C-5), 132,0 (C-1), 124,6 (C-11), 123,1 (C-7), 42,4 ( C-9), 41,4 (C-3), 27,3 (C-2), 19,3 (C-14), 15,9 (C-2), 9,9 ( C-13) (doplňující údaje). Ze srovnání těchto údajů s údaji uváděnými v literatuře [21] byla látka identifikována jako furanodienon (obr. 2). Byl izolován z Lindera pulcherrima (Nees.) Benth. ex háček. f [22], Curcuma zedoaria [19], Curcuma amada [12] a Curcuma wenyujin [23]. Jedná se o furanoskviterpenoid, který vykazuje protiplísňové [12], protizánětlivé [19], protirakovinné [24], antibakteriální a antioxidační aktivity [22].

sloučenina 3:

Nažloutlý olej; UV Xmax: nm 275. ESIMS (plus) m/z: 383,3 [M plus Na] plus, 361,3 [M plus H] plus, 343,2 [M plus H-H20] plus. 'H-NMR (CD3OD): 5 6,99 (2H, dd, J=9, 2 Hz, H-2'', -6''), 6,67 (2H, d, J=9 Hz, H-3´´, -5´´), 6,52 (2H, s, H-2´, -6´), 4,63 (1H , br b, J=12 Hz, H-1), 4,21 (1H, m, H-3), 3,89 (1H, m, H-5), 3,85 ( 3H, s, 5'-OCH3), 2,63 (2H, m, H-7), 1,82 (1H, m, H-2a), 1,78 (1H, m, H{{6{ {107}}}}a), 1,73 (1H, m, H-2b), 1,69 (1H, m, H-4a), 1,68 (1H, m, H{72} }b), 1,53 (1H, m, H-4b). 13C-NMR (CD3OD): 5 156,3 (C-4''), 149,5 (C-5'), 146,4 (C-3'), 134,5 (C-4 ´), 134,44 (C-1´), 134,41 (C-1´´), 130,4 (C-2´´, -6´´), 116,1 (C{ {104}}'', -5''), 108,0 (C-2'), 102,8 (C-6'), 75,2 (C-1), 72,6 ( C-5), 65,6 (C3), 56,6 (5'-OCH3), 41,1 (C-2), 39,5 (C-4), 39,2 (C-6) 31.8 (C-7) (doplňková data). Ze srovnání těchto údajů s údaji uvedenými v literatuře [25] byla látka identifikována jako 1,5-epoxy-3-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy{ {145}} methoxyfenyl)-7-(4-hydroxyfenyl)heptany (obr. 2). Byl izolován z oddenků Zingiber officinale a byly studovány jejich antioxidační vlastnosti [25].

sloučenina 4:

Viskózní sirup; UV Xmax: nm 281. ESIMS (plus) m/z: 385,3 [M plus Na] plus, 363,3 [M plus H] plus, 345,2 [M plus H-H20] plus. 'H-NMR (CD3OD): 5 6,75 (1H, d, J=2 Hz, H-2'), 6,68 (1H, d, J=8 Hz, H{{21 }}'), 6,64 (1H, J=8 Hz, H-5''), 6,61 (1H, J=2 Hz, H-2''), 6,60 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6'), 6,49 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6''), 3,80 (3H, s, 3'-OCH3), 3,73 (2H, m, H-3, -5), 2,{56}},47 (4H, m, H{59 }}a, -1b, -7a, -7b), 1.71-1,65 (4H, m, H-2a, {{ 68}}b, -6a, -6b), 1,61 (2H, m, H-4a, -4b). 13C-NMR (CD3OD): 5 148,8 (C-3'), 146,1 (C-3''), 145,4 (C-4'), 144,2 (C-4 ´´), 135,24 (C-1´ nebo C-1´´), 135,22 (C-1´ nebo C-1´´), 121,8 (C{{101} }}´), 120,6 (C-6´´), 116,5 (C-2´´), 116,3 (C-5´´), 116,1 (C-5´ ), 113,2 (C-2'), 70,94 (C-3 nebo C-5), 70,92 (C-3 nebo C-5), 56,4 (3 ´-OCH3), 44,9 (C-4), 40,8 (C-2, -6), 32,3 (C-1), 32,1 (C-7) (Doplňkové údaje). Ze srovnání těchto údajů s údaji uvedenými v literatuře [26, 27] byla látka identifikována jako olej 3,5-dihydroxy-1-(3,4-dihydroxyfenyl){{150 }} (4-hydroxy-3-methoxyfenyl)heptany (obr. 2). Byl izolován z oddenků Tacca chantrieri [26] a Curcumalonga L. [27]. Jsou to diarylheptanoidy, které vykazují cytotoxické [26] a protinádorové [27] aktivity.

Sloučenina 5:

Bezbarvý olej; UV Amax nm: 279. ESI-MS (plus) m/z: 413,3 [M plus Na] plus, 391,3 [M plus H] plus, 373,3 [M plus HH20] plus. 'H-NMR (CD3OD): 5 6,76 (1H, s, H-2''), 6,67 (1H, d, J=8 Hz, H{{2{114}}}} ´´), 6,21 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´), 6,53 (2H, s, H-2´, -6´´ ), 4,63 (1H, br d, J=12 Hz, H-1), 4,21 (1H, m, H-3), 3,83 (3H, s, 5'-OCH3) , 3,78 (3H, s, 3-OCH3), 2,65 (2H, m, H-7), 1,84 (1H, m, H-2a), 1,79 (1H, m, H-6a), 1,74 (1H, m, H-2b), 1,69 (1H, m, H-4a), 1,68 (1H, m, H{{ 75}}b), 1,53 (1H, m, H-4b). 13C-NMR (CD3OD): 5 149,5 (C-5'), 148,8 (C-3''), 146,4 (C-3'), 145,4 (C-4 ´´), 135,3 (C-1´), 135,2 (C-1´´), 134,4 (C-4´), 121,9 (C-6´´), 116,1 (C-5´´), 113,4 (C-2´´), 108,0 (C-2´), 102,7 (C-6´), 75,2 (C{ {121}}), 72,5 (C-5), 65,6 (C-3), 56,6 (5'-OCH3), 56,3 (3''-OCH3), 41,2 (C{140} }), 39,4 (C-4), 39,3 (C-6), 32,2 (C-7) (doplňková data). Ze srovnání těchto údajů s údaji uvedenými v literatuře [20] byla látka identifikována jako 1,5-epoxy-3-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy{ {157}}methoxyfenyl)- 7-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl) heptany (obr. 2) a neexistují žádné informace o jejich biologické aktivitě. Sloučeniny 3, 4 a 5 jsme izolovali poprvé z C. amada. Všechny sloučeniny vykazovaly inhibiční aktivitu proti houbové tyrosináze

Pět sloučenin, jmenovitě zederon, furanodienon, 1,5-epoxy-3-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy-5-methoxyfenyl)- 7-( 4-hydroxyfenyl)heptany, 3,5-dihydroxy-1-(3,4-nečistý hydroxyfenyl)-7-(4-hydroxy-3- methoxyfenyl) heptany a 1,5-epoxy-3-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy-5-methoxyfenyl)- 7-(4- hydroxy-3-methoxyfenyl)heptany, byly izolovány z frakcí F3 a F6. Izolované sloučeniny vykazovaly anti-tyrosinázovou aktivitu způsobem závislým na koncentraci. Mezi pěti sloučeninami vykazovala sloučenina 4 významně silnější anti-tyrosinázovou aktivitu než arbutin. Mezi sloučeninou 5 a arbutinem nebyly žádné významné rozdíly v účincích proti tyrosináze (obr. 3). Účinky izolované sloučeniny na buněčnou životaschopnost byly studovány na buňkách myšího melanomu B16F10. Buňky byly ošetřeny 50, 100, 200 a 400 uM koncentracemi sloučeniny po dobu 48 hodin. Izolované sloučeniny nevykazovaly cytotoxické účinky do 200 μM, nicméně asi padesát procent buněčných úmrtí bylo pozorováno ve všech případech při koncentraci 400 μM (obr. 4). K posouzení jejich intracelulárních antityrosinázových a antimelanogenních účinků byly tedy použity koncentrace až 200 μM.

Pro stanovení anti-melanogenní a anti-tyrosinázové aktivity izolovaných sloučenin byly hodnoceny jejich účinky na obsah melaninu a tyrosinázovou aktivitu v melanomových buňkách B16F10. Jak je uvedeno v tabulce 1, naše izolované sloučeniny inhibovaly v závislosti na dávce intracelulární obsah melaninu a aktivitu tyrosinázy. Sloučenina 4 byla významně silnější než pozitivní kontrolní léčivo arbutin v inhibičních účincích na melanin i tyrosinázu. Nebyl pozorován žádný významný rozdíl mezi sloučeninou 5 a arbutinem. Protože buněčná tyrosináza zvyšuje produkci melaninu, snížení aktivity tyrosinázy je účinnou strategií pro vývoj antimelanogenních činidel. Za tímto účelem jsme hodnotili inhibiční vlastnosti aktivity intracelulární tyrosinázy a melanogeneze v buňkách melanomu B16F10. Podobně jako u nálezů inhibiční aktivity tyrosinázy hub, izolované sloučeniny inhibují intracelulární aktivitu tyrosinázy a melanogenezi způsobem závislým na dávce. Antityrosinázové účinky izolovaných sloučenin vedly k jejich antimelanogenním vlastnostem. Pořadí anti-tyrosinázové a antimelanogenní aktivity těchto sloučenin bylo sloučenina 4 > arbutin > 5 > 2 > 3 > 1. Vypočtená hodnota IC50 sloučeniny 4 byla významně nižší než hodnota arbutinu. Účinnost sloučeniny 4 byla 1.{25}} až 5-krát vyšší než u ostatních čtyř sloučenin. Sloučenina 5 také vykazovala silnou anti-tyrosinázovou aktivitu, která byla srovnatelná s aktivitou arbutinu. Naše výsledky ukázaly, že sloučeniny 4 a 5 by mohly být použity jako potenciální přírodní inhibitory tyrosinázy a kosmetika pro bělení kůže. Předpokládá se, že oxidační stres je zapojen do základního mechanismu nadprodukce melaninu [28]. Proto byla antioxidační role zkoumána u široké škály kožních poruch, včetně fotokarcinogeneze nebo melanomu [9]. My a jiní jsme již dříve uvedli antioxidační vlastnosti C. amada [13, 29], které mohou být zodpovědné za antimelanogenní účinky izolovaných sloučenin. V této studii jsme detekovali inhibiční účinky izolovaných sloučenin na intracelulární syntézu melaninu a aktivitu tyrosinázy indukovanou -MSH. Naše izolované sloučeniny tedy mohou být použity jako činidla ve funkční kosmetice pro vyvinutí účinných ošetření pro bělení pokožky.

Závěr

Důrazně se domníváme, že C. amada může hrát důležitou roli jako účinný inhibitor tyrozinázy. C. amada a její bioaktivní sloučeniny by mohly být použity v kosmetickém průmyslu jako přírodní bělící činidla, v potravinářském průmyslu jako činidla proti hnědnutí a v lékařské oblasti pro léčbu hyperpigmentace. Nicméně jsou zapotřebí další studie ke zkoumání antimelanogenních účinků izolovaných sloučenin na zvířecích modelech.

Materiály a metody

Chemikálie

Tyrosináza z hub a arbutin byly zakoupeny od Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). L-tyrosin byl od společnosti Wako pure chemical industry Ltd. (Osaka, Japonsko). Methanol (MeOH), ethylacetát (EtOAc) a n-hexan byly zakoupeny od Nacalai Tesque (Kyoto, Japonsko). Byl zakoupen silikagel (63–200 μm, Kanto Chemical Co. Tokyo, Japonsko) a MeOH-d4 (CD3OD, Merck KGaA, Německo).

Příprava rostlinného materiálu Čtyři různé druhy kurkumy, jmenovitě C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada a C. zedoaria, byly pěstovány na poli šedé půdy (hrubý písek 3,6 procenta, jemný písek 30,9 procenta , bahno 24,3 procent , jíl 32,8 procent , pH 7,4, NO{{10}}}N 0,07 procent , NH4-N 0,08 procent , P 4,6 ng/g, K 42,9 ng/g) při Subtropické terénní vědecké centrum, University of the Ryukyus, Okinawa, Japonsko. Průměrná měsíční teplota, vlhkost a srážky během kultivačního období byly 17–29 stupňů, 61–83 procent a 22–369 mm. Byly poskytnuty běžné agronomické postupy včetně hnojiv a zavlažování. Oddenky byly sklizeny, když všechny výhonky druhu úplně uschly. Oddenky byly omyty, nakrájeny a sušeny v horkovzdušné sušárně při 50 stupních po dobu 72 hodin.

Extrakce vzorků

Extrakce byly prováděny rozpuštěním různého prášku kurkumy (300 g) v MeOH (3 1) při teplotě místnosti (25 stupňů) a atmosférickém tlaku a udržovány po dobu dvou dnů za nepřetržitého magnetického míchání, aby se zabránilo oxidaci vzduchem a stínění před slunečním zářením. Sloučeniny rozpustné v rozpouštědle byly filtrovány pomocí filtračního papíru (č. 2, Advantec, Tokyo Roshi Kaisha Ltd., Tokio, Japonsko). K použitému rostlinnému materiálu byla přidána čerstvá rozpouštědla (MeOH) a proces byl třikrát opakován. Filtrované roztoky obsahující rostlinné sloučeniny byly sušeny na rotační odparce za sníženého tlaku při 40 stupních. Výtěžek všech extraktů byl uchováván v chladničce při 4 stupních pro experimentální analýzy.

Test inhibice tyrosinázy

Inhibiční aktivita tyrosinázy byla stanovena podle předchozí metody [30], měřením koncentrace DOPA chromu produkovaného působením enzymu tyrosinázy na tyrosinový substrát. Stručně, testovaný vzorek byl rozpuštěn v 80% MeOH, aby se získaly různé koncentrace (25, 50 a 100 ug/ml). 96-jamková destička byla připravena v následujícím pořadí: 120 μl fosfátového pufru (20 mM, pH 6,8), 20 μl vzorku a 20 μl houbové tyrosinázy (500 U/ml v 20 mM fosfátu vyrovnávací paměť). Po inkubaci po dobu 15 minut při 25 stupních byla reakce zahájena přidáním 20 ul 0,85 mM roztoku L-tyrosinu a poté byla inkubována 10 minut při 25 stupních. Aktivita tyrosinázy byla stanovena měřením absorbance při 470 nm pomocí čtečky mikrodestiček (spektrofotometr Biotek Powerwave XS2). Arbutin byl použit jako pozitivní kontrola, zatímco 80% MeOH byl použit jako negativní kontrola. Procento inhibice tyrosinázy bylo vypočteno následovně:

kde C je absorbance negativní kontroly, B je absorbance slepého pokusu a S je absorbance testovaného vzorku.

Izolace bioaktivních sloučenin ze surového extraktu Curcuma amada

S ohledem na výsledky čtyř extraktů z kurkumy vykazovala C. amada významně vyšší antityrosinázovou aktivitu než ostatní. Proto byla provedena biotestem řízená purifikace aktivních sloučenin ze surového extraktu C. amada. Pro identifikaci anti-tyrosinázových sloučenin byla provedena frakcionace ze surového extraktu C. amada, jak je popsáno na obr. 5. Surový extrakt byl zředěn destilovanou vodou a poté extrahován n-hexanem a následně EtOAc. Stejné objemy každého rozpouštědla a roztoku surového extraktu byly poté smíchány třepáním po dobu 3 minut v dělicí nálevce. Všechny frakce byly zakoncentrovány do sucha na rotační odparce při 40 stupních. Anti-tyrosinázové aktivity těchto tří frakcí byly stanoveny podle výše uvedeného postupu. Protože EtOAc frakce vykazovala nejvyšší anti-tyrosinázovou aktivitu, byla vybrána pro izolaci a čištění bioaktivní sloučeniny. Aktivní EtOAc frakce byla odpařena do sucha a podrobena chromatografii na sloupci silikagelu (75 g) (30 x 3 cm). Eluce byla provedena za použití n-hexanu a EtOAc se zvyšujícím se množstvím EtOAc [100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5). a 0:100 (F6)]. Anti-tyrosinázová aktivita těchto šesti frakcí byla provedena podle výše uvedeného postupu a většina aktivit byla nalezena v F3 a F6. Frakce F3 a F6 byly purifikovány pomocí C18 HPLC s reverzní fází (COSMOSIL 5C18-AR-II; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japonsko) vybavenou vodou a acetonitrilem jako mobilní fází s průtokem 2,5 ml min-1, detekováno při 280 nm.

Tři píky z F3 eluované při 9,55, 13,66 a 16,47 min a čtyři píky z F6 eluované při 11,56, 12,20, 12,75 a 15.03 min jako bezbarvé bílé látky, z toho inhibiční aktivita byla detekována v pěti vrcholových frakcích eluovaných v 9,55 a 16,47 min z F3 a 11,56, 12,75 a 15.03 min (doplňková data) z F6 (obr. 5). Izolované sloučeniny (-10 mg) byly rozpuštěny v MeOH-d4 a poté podrobeny spektrální analýze. Spektra nukleární magnetické rezonance (NMR) byla zaznamenána na BRUKER NMR spektrometrech (500 MHz pro 1H a 125 MHz pro 13C) při teplotě místnosti. Chemické posuny (5) byly zaznamenány jako části na milion (ppm) vzhledem k tetramethylsilanu (TMS) jako vnitřnímu standardu. Experimenty hmotnostní spektrometrie byly prováděny na hmotnostním spektrometru Waters s použitím elektrosprejové ionizační sondy (ESI - MS) za následujících instrumentálních podmínek: Kolona: COSMOSIL 5C18-}AR-II, (2 x 150) mm. Rozpouštědlo A: Voda (0,1 procenta kyseliny mravenčí), Rozpouštědlo B: acetonitril, průtok: 4 ml/min, vstřikovaný objem: 100 µL, doba chodu: 35 min, časový program pro F3: 75 procent B (0 min) → 75 procento B (20 min) → 100 procent B (20,1 min) → 100 procent B (27 min) → 75 procent B (27,1 min) → 75 procent B (35 min). Časový program pro F6: 45 procent B (0 min) → 45 procent B (14 min) → 100 procent B (14,1 min) → 100 procent B (20 min) → 45 procent B (20,1 min) → 45 procent B (25 min). Režim pumpy: Binární gradient. Podrobnosti o troubě: CTO-20AC, teplota 40 stupňů . MS ionizační režim: ES (plus), kapilární napětí: 4,0 kV, kuželové napětí: 20 V, teplota zdroje: 120 stupňů, desolvační teplota: 350 stupňů, průtok kuželového plynu: 100 l/h, průtok desolvatačního plynu: 800 l /h (doplňková data).

Anti-tyrosinázová aktivita izolovaných sloučenin

Izolované sloučeniny byly rozpuštěny v MeOH v koncentracích 5, 10, 30, 50, 100 a 200 uM pro každou sloučeninu. Anti-tyrosinázová aktivita byla stanovena za použití postupu popsaného výše.

Intracelulární inhibice tyrosinázy a melanogeneze izolovanými sloučeninami

Buněčná kultura

Buňky melanomu B16F10 byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM) doplněném 10% tepelně inaktivovaným fetálním bovinním sérem (FBS) a 1% penicilinem (10,{6}} U/ml)/streptomycinem (100 ug/ml) při 37 stupních ve vlhké atmosféře obsahující 5 procent CO2.

Životaschopnost buněk

Buňky B16F10 byly naneseny v hustotě 5 x 104 buněk/jamku na 96-jamkovou destičku. Po 24 hodinách byly buňky vystaveny různým koncentracím izolované sloučeniny a inkubovány dalších 48 hodin při 37 stupních. Po inkubaci byla buněčná životaschopnost stanovena testem MTS. Bylo přidáno dvacet mikrolitrů roztoku MTS a inkubováno po dobu 60 minut. Po inkubaci byla stanovena absorbance buněk při 490 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Benchmark Plus).

Antityrosinázové a antimelanogenní aktivity izolovaných sloučenin

Stanovení obsahu buněčného melaninu a testy aktivity tyrosinázy byly provedeny tak, jak bylo popsáno dříve [31], s mírnými modifikacemi. Buňky melanomu B16F10 byly naneseny v hustotě 5 x 104 buněk/jamku na 96-jamkovou destičku. Po 24 hodinách byly buňky vystaveny různým koncentracím izolované sloučeniny nebo arbutinu. Po 1 hodině bylo přidáno 100 nM hormonu stimulujícího melanocyty (-MSH) a buňky byly inkubovány dalších 48 hodin při 37 stupních. Pro studii anti-tyrosinázové aktivity byly buňky poté promyty ledově chladným fosfátovým pufrem a lyžovány fosfátovým pufrem (pH 6,8) obsahujícím 1 procento Triton-X (90 ul/jamku). Destičky byly zmraženy na -80 stupňů po dobu 30 minut. Po rozmrazení a promíchání bylo do každé jamky přidáno 10 ul 1% L-DOPA. Po inkubaci při 37 stupních po dobu 2 hodin byla měřena absorbance při 490 nm. Pro stanovení obsahu melaninu byly buňky dvakrát promyty fosfátovým pufrem a poté rozpuštěny ve 100 ul NaOH (1 N) obsahujícím 10 procent DMSO. Vzorky byly inkubovány při 80 stupních po dobu 1 hodiny a smíchány, aby došlo k rozpuštění melaninu. Optická hustota směsného homogenátu byla měřena při 490 nm.

Statistická analýza

Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. Statistické rozdíly mezi těmito dvěma průměry byly hodnoceny Studentovým t-testem. Vícenásobná srovnání byla provedena pomocí jednosměrné analýzy rozptylu následované Bonferroniho testem. Rozdíly byly považovány za významné při P <>

Toto je náš produkt proti únavě! Pro více informací klikněte na obrázek!

Reference

1. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem GH. Hypopigmentovaná činidla: aktualizovaný přehled biologických, chemických a klinických aspektů. Pigment Cell Res. 2006;19:550–71.

2. Loizzo MR, Tundis R, Menichini F. Přírodní a syntetické inhibitory tyrosinázy jako činidla proti hnědnutí: Aktualizace. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2012;11:378–98.

3. Lin YS, Chen HJ, Huang JP, Lee PC, Tsai ČR, Hsu TF a kol. Kinetika inhibiční aktivity tyrosinázy pomocí extraktů listů Viti's vinifera. Biomed Res Int. 2017:5232680.

4. Manini P, Napolitano A, Westerhof W, Riley PA, d' Ischia M. Reaktivní ortho-chinon generovaný tyrosinázou katalyzovanou oxidací činidla pro depigmentaci kůže monobenzonu: reakce samovazby a konjugace thiolů a možné důsledky pro melanocyty toxicita. Chem Res Toxicol. 2009;13:1398–405.

5. Couteau C, Coiffard L. Přehled činidel pro bělení kůže: léky a kosmetické přípravky. Kosmetika. 2016;3:27.

6. Al-Saleh I, Shinwari N, El-Doush I, Billedo G, Al-Amodi M, Khogali F. Porovnání hladin rtuti v různých tkáních albínských a pigmentovaných myší léčených dvěma různými značkami rtuťových krémů na zesvětlení pokožky. Biometals: Int J role Met ionty Biol, Biochem, Med. 2004;17:167–75.

7. Gopinath H, Karthikeyan K. Kurkuma: koření, kosmetika a lék. Indian J Dermatol Venereol Leprol. 2018;84:16–21.

8. Vaughn AR, Branum A, Sivamani RK. Účinky kurkumy (Curcuma longa) na zdraví kůže: systematický přehled klinických důkazů. Phytother Res. 2016;30:1243–64.

9. Baliga MS, Katiyar SK. Chemoprevence fotokarcinogeneze vybranými dietními rostlinnými látkami. Photochem Photobio Sci. 2006;5:243–53.

10. Akter J, Hossain MA, Sano A, Takara K, Islam MZ, Hou DX. Antifungální aktivita různých druhů a kmenů kurkumy (Curcuma spp.) proti Fusarium Solani Sensu Lato. Pharm Chem J. 2018;52:292–7.

11. Akter J, Islam MZ, Hossain MA, Kawabata S, Takara K, Nguyen H a kol. Relaxace prasečí cerebrální tepny nezávislá na endotelu a závislá na vápníkových kanálech různými druhy a kmeny kurkumy. J Tradit Complement Med. 2018;9:297–303.

12. Akter J, Takara K, Islam MZ, Hossain MA, Sano A, Hou DX. Izolace a strukturní objasnění antifungálních sloučenin z Curcuma amada. Asian Pac J Trop Med. 2019;12:123–9.

13. Akter J, Hossain MA, Takara K, Islam MZ, Hou DX. Antioxidační aktivita různých druhů a odrůd kurkumy (Curcuma spp): Izolace účinných látek. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharm. 2019;215:9–17.

14. Khunlad P, Tundulawessa Y, Supasiri T, Chutrtong W. Tyrosinázová inhibiční aktivita kurkuminoidů z prášku kurkumy (Curcuma longa Linn.). J SWU Sci. 2008;24:125–39.

15. Giang PM, syn PT. Izolace seskviterpenoidů z oddenků vietnamské kurkumy aromatické Salisb. J Chem. 2000;38:96–9.

16. Asem SD, Laitonjan SW. Zkoumání vztahu struktura-nelinearita zederonu z oddenku Curcuma caeca Roxb. Ind J Chem. 2012;51:1738–42.

17. Faiz Hossain C, Al-Amin M, Rahman KM, Sarker A, Alam MM, Chowdhury MH, et al. Analgetický princip z Curcuma amada. J Ethnopharmacol. 2015;163:273–7.

18. Ahmed Hamdi OA, Syed Abdul Rahman SN, Awang K, Abdul Wahab N, Looi CY, Thomas NF, Abd Malek SN. Cytotoxické složky z oddenků Curcuma zedoaria. Sci World J. 2014;2014:321943.

19. Makabe H, Maru N, Kuwabara A, Kamo T, Hirota M. Protizánětlivé seskviterpeny z Curcuma zedoaria. Nat Prod Res. 2006;20:680–5.

20. Kikuzaki H, Nakatani N. Cyklické diarylheptanoidy z oddenků Zingiber officinale. Fytochemie. 1996;43:273–7.

21. Dekebo A, Dagne E, Sterner O. Furanosesquiterpenes z Commiphora sphaerocarpa a příbuzné cizopasníky pravé myrhy. Fitoterapie. 2002;73:48–55.

22. Joshi SC, Mathela CS. Antioxidační a antibakteriální účinky listové silice a její složky furanodienon a curzerenon z Lindera pulcherrima (Nees.) Benth. ex háček. F. Pharmacogn Res. 2012;4:80–4.

23. Yang FQ, Li SP, Zhao J, Lao SC, Wang YT. Optimalizace podmínek GC–MS na základě rozlišení a stability analytů pro současné stanovení devíti seskviterpenoidů ve třech druzích oddenků Curcuma. J Pharm Biomed Anal. 2007;43:73–82.

24. Li YW, Zhu GY, Shen XL, Chu JH, Yu ZL, Fong WF. Furanodienon inhibuje buněčnou proliferaci a přežití potlačením ER signalizace v buňkách MCF-7 lidského karcinomu prsu. J Cell Biochem. 2011;112:217–24.

25. Tao QF, Xu Y, Lam RY, Schneider B, Dou H, Leung PS, a kol. Diarylheptanoidy a monoterpenoid z oddenků Zingiber officinale: antioxidační a cytoprotektivní vlastnosti. J Nat Prod. 2008;71:12–17.

26. Yokosuka A, Mimaki Y, Sakagami H, Sashida Y. Nové diarylheptanoidy a diarylheptanoidní glukosidy z oddenků Tacca chantrieri a jejich cytotoxická aktivita. J Nat Prod. 2002;65:283–9.

27. Jiang JL, Jin XL, Zhang H, Su X, Qiao B, Yuan YJ. Identifikace protinádorových složek v kurkuminoidech z Curcuma longa L. na základě vztahu složení-aktivita. J Pharm Biomed Anal. 2012;70:664–70.

28. Marrot L, Meunier JR. Fotopoškození DNA kůže a jeho biologické důsledky. J Am Acad Dermatol. 2008;58:139–48.

29. Policegoudra RS, Abiraj K, Channe Gowda D, Aradhya SM. Izolace a charakterizace antioxidační a antibakteriální sloučeniny z oddenku zázvoru mangového (Curcuma amada Roxb.). J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci. 2007;852:40–8.

30. Tadtong S, Viriyaroj A, Vorarat S, Nimkuntat S, Suksamrarn S. Antityrosinázové a antibakteriální aktivity extraktu oplodí mangostanu. J Health Res. 2009;23:99–102.

31. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Baicalein inhibuje melanogenezi prostřednictvím aktivace signální dráhy ERK. Int J Mol Med. 2010;25:923–7.