Antialergické a protizánětlivé účinky neferinu na buňky RBL-2H3
Jul 18, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
Abstraktní:Žírné buňky hrají velmi důležitou roli při kožních alergiích a zánětech, včetně atopické dermatitidy a psoriázy. V minulosti bylo zjištěno, že reference má protizánětlivé a protistárnoucí účinky na kůži, ale její vliv na žírné buňky zatím nebyl detailně prozkoumán. V této studii jsme použili žírné buňky (RBL{2}}H3 buňky) a myší modely ke studiu referenčních antialergických a zánětlivých účinků. Nejprve jsme zjistili, že reference inhibuje degranulaci žírných buněk a expresi cytokinů. Kromě toho jsme pozorovali, že když byly žírné buňky stimulovány A23187/forbol 12-myristát-13-acetát (PMA), zvýšení intracelulárního vápníku bylo inhibováno referenčním způsobem. Fosforylace MAPK/NF-KB dráhy je také snížena předúpravou reference. Výsledky studií in vivo ukazují, že reference může zlepšit výskyt dermatitidy a infiltrace žírných buněk způsobené dinitrochlorbenzenem (DNCB). Navíc jsou také obnoveny exprese bariérových proteinů v kůži.cistanchNakonec bylo zjištěno, že reference může snížit chování poškrábání způsobené sloučeninou 48/80. Celkově naše výsledky naznačují, že reference je velmi dobrý antialergický a protizánětlivý přírodní produkt. Jeho účinek na žírné buňky přispívá k jeho farmakologickému mechanismu.
klíčová slova:odkaz; přírodní produkt; žírná buňka; dermatitidu; svědění
1. Úvod
Mnoho studií potvrdilo, že alergická onemocnění jsou výsledkem nejen vrozené aktivace imunity, ale také adaptivní aktivace. Mezi nimi hrají žírné buňky velmi důležitou roli u různých alergických onemocnění, jako je alergická rýma, astma a alergická dermatitida. Žírné buňky exprimují na svých buněčných membránách IgE receptory (FceRI) a FceRI receptory mají vysokou afinitu k IgE protilátkám [1,2]. Když se antigen-specifický IgE naváže na FceRI, dojde k interakci a alergické reakci. Agregace FceRI může aktivovat receptorové tyrosinkinázy, iniciovat následné reakce a podporovat fosforylaci různých klíčových proteinů (jako je mitogenem aktivovaná proteinkináza; MAPK), což nakonec vede k přílivu iontů vápníku (Ca2 plus), což je klíčová událost při degranulaci žírných buněk [3].cistanche AustrálieAktivované žírné buňky degranulují a uvolňují chemické mediátory. Tyto chemické mediátory používané při alergických reakcích mohou způsobit zánět [4], takže léčba alergických příznaků zahrnuje inhibitory degranulace žírných buněk. Proto se inhibice degranulace žírných buněk zprostředkované IgE často používá k identifikaci nových sloučenin k prevenci a léčbě alergických onemocnění. Bylo zjištěno, že anti-dinitrofenyl (DNP)IgE protilátky a antigeny mohou vyvolat pasivní reakce kožní hypersenzitivity (PCA) jako typický in vivo model okamžité hypersenzitivity a jako výzkumný lék pro potenciální anti-antigenní alergie [5,6 ]. Kromě toho může být degranulace žírných buněk způsobena také neimunitními stimulanty, jako jsou sloučeniny 48/80 a A23187. A23187 vápníkový ionofor, je již dlouho známo, že stimuluje sekreci žírných buněk s uvolňováním předem vytvořených mediátorů, jako je histamin z jejich granulí, sloužící jako příklad [4] Sloučenina 48/80 je směsný polymer p-methoxy-N-methylfenethylaminu zesítěný formaldehydem, který je široce používán pro nezávislou stimulaci žírných buněk [7,8] Proto byla jako činidla ke studiu mechanismu alergických reakcí běžně používána vhodná množství sloučeniny 48/80 a A23187. Podle statistických vyhodnocení trpí atopickou dermatitidou asi 15-20 procent populace. Ať už tímto onemocněním trpí děti nebo dospělí, bez řádné léčby může atopická dermatitida způsobit pacientům psychickou tíseň a zatížit jejich rodinné a sociální zdravotní náklady [9]. Bohužel neexistuje žádná vhodná léčebná metoda k vyléčení alergické dermatitidy. Současné možnosti léčby se stále vyhýbají alergenům způsobujícím onemocnění a kontinuální užívání steroidů je zlatým standardem léčby. Nevyhnutelné alergeny a vedlejší účinky léků podnítily naléhavý vývoj nových terapeutických léků. Přírodní sloučeniny izolované z léčivých bylin a rostlin jsou potenciálními zdroji terapeutických činidel k prevenci a léčbě zánětlivých onemocnění a ke zlepšení kvality života pacientů s alergickými poruchami.
Cistanche může proti stárnutí
Odkaz pochází z lotosového jádra (embrya semene) rostliny Nelumbo nucifera a je hlavním bisbenzylisochinolinovým alkaloidem. Existují důkazy, že reference má širokou škálu farmakologických vlastností, jako jsou protirakovinné, antioxidační, protizánětlivé a neuroprotektivní účinky u mnoha onemocnění [10-15].cistanche výhodyKhan a kol. zjistili, že reference vytváří účinky proti stárnutí vlivem UV záření tím, že inhibuje UV zprostředkované zvýšení hladin ROS a malondialdehydu (MDA) v lidských keratinocytech a fibroblastech[16,17]Nedávno jsme zjistili, že reference má potenciál jako alternativní medicína pro léčbu atopických dermatitida nebo jiná zánětlivá onemocnění související s kůží[18]. Stále však zůstává nejisté, zda reference má antialergický účinek na žírné buňky. V této studii jsme se zaměřili na prozkoumání účinků reference na alergická onemocnění zprostředkovaná žírnými buňkami pomocí linií lidských žírných buněk (RBL-2H3 buňky) a sloučeniny 48/80- a anafylaxe vyvolané DNCB model myši.
La referencia proviene del núcleo de loto (el embrión de la semilla) de la planta Nelumbo nucifera y es un importante alcaloide de bisbencilisochinolina. Existe evidence de que la reference on aamplia gama de propiedades farmacologicas, como efectos anticancerígenos, antioxidantes, antiinflamatorios y neuroprotectors, en muchas enfermedades [10-15]. Beneficios de la cistanche Khan a kol. encontró que la referencia produkují efekty anti-fotoenvejecimiento al inhibir el aumento de los niveles de ROS y malondialdehído (MDA) mediado por UV en queratinocitos y fibroblastos humanos [16,17] Recientemente, tredciata descubreda referencieal paramomos de atópica dermatitis u otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la piel[18]. Sin embargo, sigue siendo incierto si la reference tiene un efecto contra la alergia cutánea en los mastocitos. En this estudio, nuestro objetivo fue fue investigar los efectos de reference en las enfermedades alérgicas mediadas por mastocitos, utilizando líneas de mastocitos humanos (células RBL-2H3) y un modelo de rato4CB/ ratoporones conducest a computing .
2. Výsledky
2.1. Test cytotoxicity neferinu na krysích žírných buňkách (RBL-2H3)
Vzhledem k tomu, že krysí bazofilní leukémie (RBL)-2H3 buňky, analog žírných buněk uvolňující histamin, jsou vhodnými buňkami pro zkoumání účinků zánětu zprostředkovaného žírnými buňkami [19], použili jsme tyto buňky ke zkoumání antialergického účinky reference. Nejprve jsme testovali, zda reference může vyvolat cytotoxicitu v žírných buňkách. Když jsou buňky předem ošetřeny referenčním roztokem od 1 do 30 μM po dobu 24 hodin, buněčná životaschopnost buněk nebude ovlivněna ošetřením referenční látky (obrázek 1).
2.2. Neferin snižuje degranulační účinek RBL-2H3 stimulovaného různými aktivátory
Buňky RBL-2H3 se běžně používají pro in vitro studie degranulace [20-22]Stimulace buněk RBL-2H3 pomocí anti-dinitrofenolu (DNP)IgE a lidského sérového albuminu konjugovaného s DNP (HSA) spouští degranulaci. Kromě toho je známo, že žírné buňky degranulují v reakci na syntetické sloučeniny, jako je sloučenina 48/80 a ionofor vápníku A23187, a tyto sloučeniny byly použity jako vhodná činidla pro přímé studie mechanismů alergických reakcí in vitro [23, 24]. Výsledky ukázaly, že cytoplazma RBL-2H3, která nebyla aktivována aktivátorem, obsahovala omezené sekreční granule.cistanche cholesterolLéčba referenční （10μM） samotná neovlivnila aktivitu RBL-2H3 (obrázek 2A, B). Nicméně přidání různých aktivátorů, včetně sloučeniny 48/80, A23187 a anti-DNP/IgE plus DNP/HSA, jasně naplnilo cytoplazmu sekrečními granulemi. Pod elektronovým mikroskopem je vidět, že v cytoplazmě je velké množství sekrečních granulí a některé sekreční granule dokonce fúzují s buněčnou membránou, což vede k degranulaci (obrázek 2C-E). Po předběžném ošetření referenčním 10 uM byly sekreční granule v cytoplazmě významně sníženy (obrázek 2F-H). Tyto výsledky naznačují, že reference může účinně inhibovat aktivaci a degranulaci RBL-2H3 stimulovanou aktivátorem.
2.3. Neferin inhibuje PMA/A23187-indukované zvýšení intracelulárního vápníku v RBL-2H3
Ionty vápníku hrají roli sekundárního posla v procesu aktivace buněk. A23187 je nejúčinnější způsob, jak zvýšit pronikání iontů vápníku přes buněčné membrány a stimulovat aktivaci žírných buněk. Forbol myristát acetát (PMA) může aktivovat proteinkinázu Cand a zvýšit intracelulární ionty vápníku, aby se zvýšil účinek A23187. Zvýšení vápníkových iontů v žírných buňkách bylo také považováno za důležitý faktor při indukci aktivace žírných buněk, takže ovlivňuje degranulaci žírných buněk a uvolňuje více zánětlivých cytokinů a chemokinů.vedlejší účinky cistanche deserticola,Tato studie se proto snažila prozkoumat, zda může reference inhibovat koncentraci vápenatých iontů v RBL-2H3, když inhibuje zánět. Experimentální skupina byla rozdělena na s nebo bez referenčního předběžného ošetření po dobu 20 minut a ke stimulaci a aktivaci RBL-2H3 byly přidány 1 mM CaClz a PMA/A23187. Experimentální výsledky ukázaly, že samotné ošetření RBL-2H3 různými referenčními koncentracemi neovlivnilo zvýšení intracelulární koncentrace iontů vápníku. Ve skupině s PMA/A23187-indukovaným přítokem Ca2t se významně zvýšila intracelulární koncentrace vápenatých iontů. Buňky RBL-2H3 byly předem ošetřeny po dobu 20 minut s referenční （3 μM a 10 μM） a koncentrace vápenatých iontů byla významně snížena (obrázek 3).
2.4. Neferin snížil mRNA expresi prozánětlivých cytokinů v PMA/A23187 stimulované RBL-2H3
Imunitní reakce kůže zvýší počet žírných buněk v těle a žírné buňky pak produkují prozánětlivé cytokiny a urychlují postup onemocnění. Prozánětlivé cytokiny, zejména TNF-a, IL-6, IL-1 a IL-8, nejen indukují zánět, ale také způsobují infiltraci leukocytů, tvorbu granulomů a tkáňovou fibrózu. PMA/A23187 působí na žírné buňky a indukuje je k produkci IL-16, IL-6, TSLP a TNF-, což způsobuje zánět související s alergií. Proto jsme předem ošetřili RBL-2H3 s referencí po dobu 20 minut a stimulovali pomocí PMA/A23187 po dobu 6 hodin, abychom zjistili, zda reference může down-regulovat expresi mRNA IL-1 , IL{{ 19}}, TSLP a TNF-a. Výsledky ukázaly, že ve skupině léčené pouze referencí nebyla exprese cytokinové mRNA ovlivněna a exprese mRNA ve skupině, která indukovala zánět PMA/A23187, se významně zvýšila. Ve skupině léčené odkazem bylo pozorováno, že hladiny exprese mRNA IL-1, IL-6, TSLP a TNF-a byly významně potlačeny (obrázek 4).
2.5. Neferin inhibuje PMA/A23187-indukovanou fosforylaci dráhy MAPK v RBL-2H3
Předchozí studie poukázaly na to, že žírné buňky potřebují k aktivaci MAPK uvolnit intracelulární ionty vápníku. Kromě toho signální dráha MAPK reguluje expresi monocytů, T lymfocytů, B lymfocytů, cytokinů a chemokinů a indukuje autoimunitu. Tento mechanismus je podobný aktivační dráze PMA/A23187. V této studii jsme zkoumali, zda se reference může podílet na regulaci drah MAPK. Ošetřili jsme různé referenční koncentrace (1, 3 a 10 uM) RBL-2H3 po dobu 20 minut a poté jsme stimulovali pomocí PMA/A23187 po dobu 30 minut, abychom vyvolali zánět. Výsledky ukázaly, že když byl RBL-2H3 ošetřen pouze různými referenčními koncentracemi, aktivace proteinů p38, JNK a ERK nebyla ovlivněna. Ve skupině léčené samotným PMA/A23187 jsme zjistili, že proteiny p38, JNK a ERK byly aktivovány a mají významnou fosforylaci. Ve skupině předem ošetřené referenční látkou bylo pozorováno, že pro vyšší koncentrace referenční látky byla fosforylace proteinů p38, JNK a ERK významně snížena (obrázek 5A-C).
2.6. Neferin inhibuje PMA/A23187-indukovanou fosforylaci dráhy NF-B v RBL-2H3
Exprese prozánětlivých cytokinů závisí na aktivaci transkripčního faktoru NF-kB v žírných buňkách. Když byl protein IKB fosforylován a degradován, NF-kB se uvolnil a migroval do jádra, vázal se na své odpovídající prvky reagující na DNA a podporoval transkripci prozánětlivých mediátorů. Bylo produkováno mnoho cytokinů a chemokinů, které regulují imunitní odpověď, diferenciaci a zánět. Proto jsme zkoumali, zda předběžné ošetření s odkazem ovlivňuje fosforylaci proteinu indukovanou PMA/A23187. Ošetřili jsme různé referenční koncentrace (1,3 a 10 μM) vůči RBL-2H3. Po 20 minutách stimuloval PMA/A23187 RBL-2H3 po dobu 1 hodiny nebo 2 hodin, aby vyvolal zánět. Výsledky ukázaly, že samotné ošetření RBL-2H3 různými referenčními koncentracemi neovlivnilo fosforylaci IKBa a NF-KB. Když byl PMA/A23187 použit pro stimulaci, bylo pozorováno významné zvýšení fosforylace IkBo a NF-KB. Ve skupině předem ošetřené referenční látkou bylo zjištěno, že fosforylace IkBa (obrázek 6A) a NF-KB (obrázek 6B) byla významně snížena.
2.7. Vliv neferinu na 2,4-dinitrochlorbenzenem (DNCB) indukovanou atopickou dermatitidu
DNCB, zvířecí model pro výzkum onemocnění, je reprezentativní dráždidlo, které způsobuje atopickou dermatitidu[25]. Náš experiment používá 1 procento dinitrochlorbenzenu (DNCB) rozpuštěné v 75 procentech alkoholu k vyvolání první fáze senzibilizační reakce. Referenční (3 mg/kg a 10 mg/kg) a dexamethason (Dexa,{{10}},2 mg/kg) rozpuštěné v DMSO byly podávány intraperitoneálně pátý den po dobu deseti dnů . 8., 1. a 14. den bylo aplikováno 0,5 procenta DNCB jako druhé stadium vyvolání zánětu. Myši byly rozděleny do čtyř skupin – kontrolní skupina, DNCB skupina, referenční skupina a skupina léčená dexametazonem – a poté, po srovnání mezi skupinami, byly zaznamenány rozdíly. Pozorovali jsme, že DNCB vyvolal atopickou zánětlivou reakci na kůži myší. Po aplikaci DNCB bylo zjištěno, že kůže myší zvýšila zarudnutí a šupinatění. To vše je způsobeno abnormální proliferací keratinocytů, infiltrací a agregací imunitních buněk. Skupina léčená referenční dávkou 3 mg/kg a dexamethasonem 0,2 mg/kg po dobu čtyř dnů měla zmírněné zarudnutí. Pokračovali jsme v pozorování stavu dorzální kůže myší až do 15. dne. Ve srovnání s kontrolní skupinou měla skupina DNCB silně zarudlou a oteklou kůži a vyskytovaly se lupy a rány, které se zdály být způsobeny svěděním a bolestí . Můžeme nalézt trend klesajícího stupně po léčbě referenční a dexamethasonem (obrázek 7A). K pozorování počtu agregovaných žírných buněk bylo použito barvení toluidinovou modří. Při pozorování pod mikroskopem se žírné buňky jevily fialové. Lze kvantitativně prokázat, že mnoho žírných buněk infiltrovalo a akumulovalo se v dermis v experimentální skupině DNCB, významně zvýšené ve srovnání s kontrolní skupinou. Ve skupině léčené referenční látkou a dexamethasonem byla infiltrace, agregace a počet žírných buněk sníženy (obrázek 7B, C).
2.8. Neferin zlepšuje expresi mRNA molekul souvisejících s bariérou po léčbě DNCB
Zánět související s kůží způsobený AD může způsobit abnormální funkci kožní bariéry. Pokud je kožní bariéra defektní, je pro antigeny nebo dráždivé látky snazší proniknout do kožní epidermis a dostat se do těla, aby vyvolaly imunitní reakce. Současně bude potlačena tvorba diferenciačních proteinů, včetně filagrinu, loricrinu a involukrinu. Proto je obnova poškozené kožní bariéry velmi důležitá pro prevenci a léčbu AD [26]. V naší studii jsme použili odkazy k zásahu do zvířecího modelu atopické dermatitidy vyvolané DNCB. Po usmrcení myší byla dorzální kožní tkáň uzemněna pro analýzu RI-qPCR, aby se vyhodnotilo, zda reference může zlepšit snížení exprese mRNA u filagrinu, loricrinu a involukrinu po léčbě DNCB. Výsledky ukázaly, že experimentální skupina DNCB měla významně sníženou expresi mRNA filagrinu, loricrinu a involukrinu ve srovnání s kontrolní skupinou. Exprese mRNA filagrinu, loricrinu a involukrinu byla významně zvýšena ve skupině léčené referenční látkou a dexamethasonem ve srovnání se skupinou DNCB (obrázek 8).
Dále jsme dokázali, že reference má antialergický účinek proti poškrábání. Použili jsme činidlo pro degranulaci žírných buněk, sloučeninu 48/80, k vyvolání škrábání u myší BALB/c. Jak je znázorněno na obrázku 9, zjistili jsme, že ošetření referenční látky inhibovalo škrábání způsobené sloučeninou 48/80 (50 ug/místo). Opakované podávání nižších a vyšších referenčních dávek (3 a 10 mg/kg) po dobu 5 po sobě následujících dnů významně snížilo počet škrábanců způsobených sloučeninou 48/80.
