Abstraktní
Účel: Tato studie byla provedena za účelem potvrzení použitelnosti směsného bylinného extraktu (MHE) jako analgetikakosmetika proti stárnutípřísada zkoumáním jejípleť proti stárnutíaktivity in vitro a in vivo. Metody: V této studii jsme MHE připravili pomocí ultrazvukové extrakce obsahující Forsythiae fructus, Tribuli fructus, tuleň šalamounsky, sibiřský ženšen, Ponciri Fructus a Ginseng. Vyšetřovali jsmeanti-aging účinek MHE na kůži v dermálních fibroblastech. Theaktivita proti stárnutíbyla určena hladinami syntézy kolagenu typu I. Hladiny mRNA matricové metaloproteinázy-1 (MMP1) a tkáňového inhibitoru metaloproteináz 1 (TIMP1) byly měřeny pomocí qRT-PCR. Hladiny proteinu MMP1 byly hodnoceny blotovací analýzou. Klinické testy vlhkosti pokožky, elasticity, textury a vrásek byly provedeny pomocí kosmetiky obsahující 1 procento MHE. Výsledky: MHE indukoval upregulaci syntézy pro-kolagenu typu I a exprese TIMP1 mRNA. MHE vedl k downregulaci hladin MMP1 mRNA a hladin proteinů. Navíc po aplikaci kosmetiky obsahující 1 procento MHE na kůži se 4 týdny po ošetření zlepšila hydratace pokožky, elasticita, textura a vrána. Závěr: MHE působí proti stárnutí tím, že podporuje syntézu kolagenu a potlačuje expresi genu MMP1 in vitro a má účinek na zlepšení pokožky in vivo. Proto se ukázalo, že MHE má hodnotu jako funkční kosmetická přísada.
klíčová slova:Péče o kůži, Proti stárnutí, Proti vráskám, Přírodní kosmetika, Bylinná medicína
Bylinné doplňky Cistanche proti stárnutí
Úvod
Kůže je orgán, který přichází do kontaktu s vnějším prostředím a je životně důležitý pro naše přežití, funguje jako primární bariéraproti vnějším útokůmjako jsou infekční agens a fyzické zranění; kromě toho plní několik důležitých fyziologických rolí (Slominski et al., 2004; Vollmer et al., 2018). Jak stárneme,funkce kůžepostupně se zhoršuje s atrofickými změnami v důsledku ultrafialových (UV) paprsků, znečištění a stresu a stárnutím kůže, ke kterému dochází při snižování počtu kožních buněk a tloušťky kůže (Farage et al., 2013).
Stárnutí kůželze rozdělit na endogenní stárnutí a exogenní stárnutí. K endogennímu stárnutí pokožky dochází v průběhu času přirozeně bez ohledu na vnější vlivy. Dermální-Epidermálníjunction (DEJ) soudržnost slábne as diferenciacíkeratinocytů, tvorba lipidů klesá (Makrantonakia kol., 2007). Na druhou stranu, exogenní stárnutí je způsobeno vnějšímifaktory jako UV paprsky, infračervené paprsky (IR), kouření, v pořádkuprach a životní styl. Mezi nimi je fotostárnutí způsobeno UV zářenímpaprsky pronikající kůží a poškozující kolagen a elastinv dermis. V tomto procesu se elastická vlákna a kolagenvlákna kůže se deformují, což má za následek snížení elasticitya prověšení. Kolagen je hlavní složkou extracelulárnímatrice a má důležitou roli při určování funkce tkáně.
Mezi různými typy kolagenu tvoří kolagen typu 1 asi 75-80 procent celkového kolagenu (Landau, 2007; Lovell a kol., 1987; Mays a kol., 1988). Když je kůže vystavenaUV záření po dlouhou dobu, produkují se volné radikály. Tyto zdarmaradikály stimulují expresi matricové metaloproteinázy-1(MMP1), který podporuje degradaci kolagenu a inhibuje kolagensyntéza, která snižuje elasticitu pokožky a vede k vráskám.Proto k prevenci a zlepšení kožních vrásek způsobenýchstárnutí, je nutné vyvinout složku, která podporujeprodukci kolagenu a inhibuje expresi a aktivituMMP1 (Wlascheka kol., 2001).
Stárnutí kůžeúzce souvisí s kvalitou života. Protože je kůže nejviditelnějším orgánem, uvědomuje si proces stárnutí (Binic et al., 2013). V oblasti medicíny, farmacie a kosmetiky probíhají různé snahypředcházet a zlepšovat stárnutí pokožky. Thevývoj přísad proti stárnutíje jednou z nejdůležitějších strategií proti stárnutí.
Pomocí ultrazvukové extrakce jsme připravili bylinné extrakty, abychom vyvinuli nové složky proti stárnutí obsahující Forsythiae fructus, Tribuli fructus, šalamounovu pečeť, sibiřský ženšen, Ponciri fructus a ženšen.
Šest rostlinných léčiv bylo vybráno z rostlin s různými léčebnými a kožními účinky. Forsythiae fructus, sušené ovoce Forsythia susspense (čeleď Oleaceae), známé jako Lian Qiaov Číně, byl poprvé zaznamenán v Shennong Bencao Jing, aprestižní monografie o tradiční čínské medicíně (TCM)(Donga kol., 2017). Byl použit jako tepelný čistič adetoxikační TCM pro léčbu infekčních onemocnění, jako je napřakutní nefritida, erysipel a vředy (Wanga kol., 2018). to ješiroce používán na klinikách jako samostatný lék nebo kombinovaný předpis.Moderní farmakologie ukázala, že má celou řadubioaktivity, včetně protizánětlivých, antibakteriálních, antivirové, antioxidační, protinádorové, antidiabetické, antihyperlipidemické,antiandrogenní alopecie, proti zvracení, proti stárnutí a protiaktivity obezity a neuroprotektivní, hepatoprotektivní avasorelaxační účinky (Donga kol., 2017). Navíc bylooznámil toForsythiae fructusmá bělící účinek, protiatopická dermatitida a účinky proti stárnutí. Podle Tchaj-wanucelostátní databáze receptů,Forsythia Fructusbylpatří mezi 10 nejlepších bylin nejčastěji používaných k léčbě atopikadermatitida (15,9 procenta), kopřivka (11.49-13,4 procenta) a akné (22,3 procenta)(Donga kol., 2017). Forsythiae fructusobsahuje saponiny,flavonoidy,a alkaloidy a kyselina oleanolová, která má užitečnéfarmakologické působení. Kromě toho obsahuje arctigenin amatairesinol. Jako fyziologicky aktivní složky pokožky jsoujsou inhibitory tyrosinázy, které působí na metabolismus melaninudráha vyvolaná - hormon stimulující melanocyty ( -MSH)a přitahují pozornost jako kosmetické bělící materiály(Yang & Choe, 2011).Tribuli fructus, což je sušené ovoceTribulus terrestrisL, bylo hlášeno, že má farmakologické účinkyaktivity pro zlepšení sexuální funkce, prevence a léčbakardiovaskulární onemocnění a zlepšení neuroprotekce aPaměť. Má také antidiabetické, protizánětlivé aantioxidační účinky (Chhatrea kol., 2014). Tribuli fructusextrakt obsahuje velké množství diosgeninu, tigogeinu, různésaponiny atd. Tyto saponiny jsou nejvýznamnější bioaktivnísložky zodpovědné za různé biologické účinky jako napřafrodiziakální účinek, antihypertenzní účinek a ochrannýúčinek proti ischemicko-reperfuznímu poškození a protirakovinný,antibakteriální a protiplísňové účinky (Chhatrea kol., 2014).
Mezi další složky patří furostanol a spirostanol saponiny, polysacharidy, flavonoidní glykosidy, alkaloidy a amidy. Kromě toho je účinný proti atopické dermatitidě u potkanů a má protizánětlivé účinky (Chhatre et al., 2014). Bylo hlášeno, že účinek extraktu Tribuli fructus proti stárnutí zvyšuje produkci prokolagenu typu I a elastinu v buňkách HS68, podporuje akumulaci lipidů v adipocytech a v konečném důsledku zlepšuje vrásky a elasticitu pokožky (Kim et al., 2016 ). Sibiřský ženšen (Acanthopanax senticosus) je opadavý keř patřící do čeledi Oga spolu se ženšenem a divokým ženšenem. Sibiřský ženšen má mnoho podobností se ženšenem a používá se jako bylinný lék na mrtvici, vysoký krevní tlak a cukrovku. Extrakt ze sibiřského ženšenu se v orientální medicíně používá odedávna a až donedávna byly v různých studiích uváděny farmakologické a fyziologické výsledky. Mezi komponenty sibiřského ženšenu, které byly dosud identifikovány, patří eleuthero strany A, B, C, D, E, I, K, L a M a sesamin, chiisanosid, kyselina kávová, kyselina chlorogenová, kampesterol, vitamíny a minerály (Park a kol., 2010).
Obsahuje triterpenoidní saponiny, lignany, kumariny aflavonoidy, mezi nimiž jsou fenolické sloučeniny považovány za nejaktivnější složky (Huang et al., 2011). Existuje mnoho zpráv o účinnosti extraktu ze sibiřského ženšenu na kůži.Účinek proti vráskám,antioxidační účinek,syntéza kolagenua byla popsána inhibiční aktivita kolagenázy proti fotostárnutí (Park et al., 2010). Bylo hlášeno, že extrakt ze sibiřského ženšenu reguluje syntézu kolagenu typu IV, ovlivňuje proliferační kapacitu epidermálních kmenových buněk a ztlušťuje epidermis (Choi et al., 2016). Tuleň šalamounka je oddenek Polygonatum odoratum (synonymum: P.officinale), který má tonizující účinek a používá se k léčbě srdečního selhání a cukrovky v orientální medicíně. Šalamounova pečeť je anticyklická a antitusická; uvolňuje srdeční napětí a je diuretikum, energizér, hypoglykemikum, sedativum a tonikum; používá se k léčbě plicních onemocnění, včetně tuberkulózy a gastrointestinálních poruch (Haroon et al., 2012). Kromě toho se široce používá při léčbě krevních poruch; má blahodárné účinky na ledvinové vývody a zabraňuje šedivění vlasů, problémům se zrakem, závratím a kožním onemocněním. Je to nervinové tonikum a používá se při léčbě cukrovky (Haroon et al., 2012). Šalamoun má vysoký obsah fenolu a antioxidační aktivitu. Homoisoflavanony ze Solomon's seal inhibují tvorbu konečných produktů pokročilé glykosylace. Solomon's seal prokázal silnou regulační aktivitu střevního imunitního systému a schopnost indukovat diferenciaci osteoklastů a apoptózu indukovanou lektinem. V případě extraktu z listů P. odoratum je jako příklad uváděna funkce hojení ran (Fathi et al., 2014). Ponciri fructus immatures je nezralý plod Poncirus trifoliata Rafinesque, patřící do čeledi Rutaceae (Jung et al., 2016). Nedávno byly popsány protizánětlivé účinky a účinky proti přecitlivělosti a byl popsán účinek extraktu z tukového kalu na indukci apoptózy rakovinných buněk (Lee et al., 2008). Je známo, že Ponciri fructus je účinný při léčbě atopické dermatitidy. Prostřednictvím kožní aplikace extraktu Ponciri fructus byly popsány jeho účinky proti atopickým dermatitidám, jako je epidermální hyperkeratóza, dermální edém a cytokiny. Zejména byl zaznamenán významný pokles svědění, počtu žírných buněk, produkce IgE a exprese nervového růstového faktoru. Extrakty z Ponciri fructus prokázaly účinný protizánětlivý účinek proti atopické dermatitidě a antipruritický účinek regulací imunitních mechanismů. Kromě toho je známo, že orální podávání extraktu Ponciri fructus je užitečné při léčbě a prevenci alergických onemocnění (Hwang et al., 1997). Ženšen je široce používaný tradiční bylinný lék s multifunkčními aktivitami. Ženšen se používá pro své protizánětlivé, antioxidační, protinádorové a anti-aging aktivity (Choi, 2008; Kim & Ko, 2020). Bylo provedeno mnoho studií o účinnosti ženšenu na kůži (He et al., 2018). Mezi nimi existuje mnoho zpráv o saponinech a ginsenosidech, které jsou reprezentativními složkami ženšenu. Saponiny jsou sloučeniny, které se hojně vyskytují ve většině rostlin a existují v různých formách. Saponiny mohou urychlit různé biologické aktivity, jako je hemolýza, a antibakteriální, antivirové a antioxidační funkce. Kromě toho mají saponiny protizánětlivé vlastnosti, které mohou snížit otoky a záněty kůže. Ginsenosidy zvyšují interleukin (IL)-1, jeden ze zánětlivých cytokinů, o kterých je známo, že podporují angiogenezi a indukují vaskulární endoteliální růstový faktor a akumulaciv místech popálení kůže u myší. Byl také popsán jejich účinek na odstraňování makrofágů z kožních ran a na podporu hojení ran (Kim et al., 2011).
Cílem této studie bylo objasnit účinek směsného bylinného extraktu (MHE) proti stárnutí pleti in vitro a in vivo.
Metody
1. Hodnocení účinnosti in vitro
1) Příprava MHE
Sušené plody Forsythia suspense, sušené plody Tribulus Terrestris L., sibiřský ženšen (Acanthopanax senticosus (Eleuthero) kořen), tuleň šalamounsky (oddenek a kořen Polygonatum Officinale), plody Poncirus Trifoliata Rafinesque (Panaxseng) zakoupené na místním trhu. Na základě teorie „Jin-Jang“ a „Pěti elementů“ tradiční čínské medicíny (TCM), Forsythia suspensa, Tribulus terrestris L. a Poncirus trifoliata Rafinesque odpovídající „Yang“ a sibiřský ženšen, ženšen a Šalamounova pečeť odpovídající Bylo vybráno "Yin". Šest léčivých bylin bylo opět rozděleno do charakteristik odpovídajících pěti živlům (dřevo, oheň, voda, kov nebo zlato a země nebo půda). Tyto léčivé byliny byly smíchány ve stejném poměru pro rovnováhu každého prvku a Poncirus trifoliata a ženšen odpovídající Zemi byly kombinovány s ostatními prvky tak, aby odpovídaly poměrům (tabulka 1). Těchto šest léčivých rostlin bylo extrahováno ve 30% etanolu pomocí ultrazvuku (20 kHz, 2 h). Po zahuštění na rotační odparce bylo přidáno 30 % (obj./obj.) butylenglykolu a roztok byl zředěn za vzniku extraktu obsahujícího 1 % pevného podílu.
Tabulka 1. Složení směsných bylin
2) Buněčné kultury a činidla
Lidské primární fibroblastové buňky (HDFn) byly získány z PromoCell (normální lidské dermální fibroblasty juvenilní předkožka, C-12300; PromoCell, Německo). Buněčné kultury s Dulbeccemmodifikovaná Eagleova středně vysoká glukóza (DMEM vysoká glukóza, SH30243.01, Hyclone, Cytiva) obsahující 10 procent (v/v) fetálního bovinního séra (FBS, SH30084.03, Hyclone) a 1 procento antibiotikaantimykotické látky (Anti-anti, 15240-062, Gibco, USA) byly kultivovány při 37 stupních v inkubátoru s 5% CO2.
3) Test životaschopnosti buněk (MTT test)
MTT test měřil životaschopnost buněk a stanovil cytotoxicitu MHE. Buňky byly nasazeny v množství 5 x 103 buněk/jamku na 96-jamkovou destičku a kultivovány po dobu 24 hodin v buněčné kultuřepodmínky. Poté jsme médium zlikvidovali, buňky promyli roztokem fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem (PBS, 21-040-CV; Corning, USA), umístili buňky do nového média bez séra aošetřili buňky koncentracemi {{0}}.01, 0.025, {{10}}.05. 0,10, 0,25, 0,50, 0,75 a 1.00 procent vzorků a buňky byly inkubovány po dobu 24 a 48 hodin. Poté jsme přidali 100 μl roztoku MTT(0,5 procenta, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 difenyl-2H tetrazoliumbromid) na každou a buňky se inkubovaly další 2 hodiny. Po odstranění kultivačního média jsme přidali 100 μl 100% dimethylsulfoxidu (DMSO), protřepávali buňky po dobu 10 minut a měřili absorbanci při 590 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Epoch 2 microplate reader, BioTek, USA).
4) Měření generace prokolagenu I. typu
Koncentrace pro-kolagenu typu I v buněčném kultivačním médiu byla měřena pomocí komerčně dostupné soupravy ELISA (Procollagen type I C-peptide EIA Kit, MK101, TaKaRaBio, Japonsko) podle pokynů výrobce. Každý vzorek byl analyzován ve třech replikátech.
5) Měření hladin exprese mRNA pomocí kvantitativního
Polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qRT PCR) Buňky byly nasazeny v množství 1×105 buněk/jamku na 6-jamkové destičky. HDFn buňky byly kultivovány po dobu 24 hodin; poté byly buňky synchronizovány s DMEM s vysokým obsahem glukózy bez FBS po dobu 24 hodin. Médium bylo nahrazeno médiem bez séra a ošetřeno koncentracemi 0.05, 0.10, 0,25, 0,5 a 0,75 procent vzorků po dobu 24 a 48 hodin. Extrakce RNA byla provedena s HDFn buňkami za použití soupravy pro extrakci RNA (TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction kit, 9767A, Takara Bio, USA) a vzorky byly purifikovány podle protokolů výrobce. Izolovaná RNA (1 ug) byla syntetizována do cDNA pomocí soupravy TR reagencie (PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser, RR047A, Takara Bio, USA). Pomocí SYRB Green Realtime PCR Master Mix (Power SYBRTM Green PCR Master Mix, 4367659, Applied BiosystemsTM, USA) a QuantStudioTM 3 (QuanStudioTM 3 Real-Time PCR instrument, A28132, Thermo Fisher Scientific, USA) stroje pro PCR v reálném čase hladiny genové exprese byly standardizovány na provozní gen glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH). Primery použité v této studii jsou uvedeny v tabulce 2. Experimenty byly provedeny v duplikátech pro tři nezávislá opakování. Analýza křivky táníbyla provedena pro každou sadu primerů.
6) Analýza Western blot
Proteinové lyzáty z fibroblastových buněk byly extrahovány lyzačním pufrem (EzRIPA Lysis Kit, WSE{0}}; ATTO Corporation, Japonsko). Ke kvantifikaci proteinů byla použita Bradfordova metoda.Stejná množství proteinů byla smíchána s 5X vzorkovým pufrem (TLP-102-01, TransLab, Korea) a denaturována při 99 stupních po dobu 10 minuty. Proteiny byly separovány pomocí 10% SDS-PAGE při 150 V po dobu 150 minut a přeneseny na PVDF membrány (Clear Blot Membrane, 3322546, ATTO Corporation, Japonsko). Membrány byly blokovány 0,5% hovězím sérovým albuminem (BSA, A4503-10G; Sigma) po dobu 1 hodiny a promyty Tris-pufrovaným fyziologickým roztokem, který obsahoval Tween-20 (10X TBS s Tween 30, TR{ {17}}; Biosesang, Korea) třikrát; membrány byly poté inkubovány s primárními protilátkami proti MMP-1 (rekombinantní anti-MMP1 protilátka [EP1249Y], ab134184, Abcam, USA), -Actin (Anti- -}aktin (N-tern) a PA0207 (Abfrontier , Korea) při 4 stupních přes noc. Po opláchnutí byly membrány ošetřeny anti-králičí IgG-křenovou peroxidázou (HRP) (Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody, #7074; Cell Signaling Technology, USA) jako sekundární protilátkou po dobu 1 hodiny. Chemiluminiscenční detekce byla provedena pomocí detekčního činidla ECL Prime Western blotting (GE Healthcare, USA) a ATTO WSE-6100 LuminoGraph (ATTO Corporation, Japonsko). Pro kvantitativní analýzu byly zachycené snímky analyzovány pomocí Image software (CS analyzátor 4, ATTO corporation, Japonsko).
7) Statistická analýza
Statistická analýza byla provedena pomocí GraphPad Prism verze 3.03 pro Windows (GraphPad Software, USA). Výsledky jsou uvedeny jako průměr ± SD ze 3 experimentů. NespárovanýByl použit Studentův t-test a hodnoty p<0.05 were considered statistically significant.
2. Hodnocení účinnosti in vivo
1) Činidla a kosmetické přípravky
Testovanými produkty byly pleťové mléko, esenční krém a oční krém; tyto krémy obsahovaly 1 procento MHE jako aktivní složku uvedenou v tabulce 3.
2) Lidští účastníci
Všichni dobrovolníci souhlasili s účelem a obsahem testu a před zahájením testu podepsali písemný informovaný souhlas. Nesměly používat žádné jiné produkty péče o pleť a testované produkty byly aplikovány na obličej v pořadí pleť-oční krém (pouze na vrána na nohy)-esence krém-lotion krém. Studie byla provedena v souladu s pokyny Helsinské deklarace a schválena Institutional Review Board of Korea National Institute for Bioethics Policy (#P01-202108-13-001).
3) Test účinnosti
Této studie se zúčastnilo 21 žen ve věku mezi 45 a 55 (průměr ±SD 50,81±2.86) let s normální kůží. Testované produkty byly aplikovány dvakrát denně (ráno a večer) po dobu 4 týdnů. Účastníci navštěvovali výzkumné centrum každé 2 týdny a testovací místa byla měřena v laboratoři, kde byla okolní teplota a relativní vlhkost udržována na 22 ± 2 stupně a 50 ± 5 procent. Účastníci se aklimatizovali 20 minut v laboratoři po umytí obličeje a byla hodnocena hydratace pokožky, elasticita, textura a vrána. Hydratace kůže byla měřena pomocí Corneometer® CM825 (C plus K electronic GmbH, Kolín nad Rýnem, Německo); elasticita byla měřena za použití Cutometer® MPA 580 (C plus K electronic GmbH, Kolín nad Rýnem, Německo) a textura a vrány byly měřeny pomocí DermaTOP 3D-HE (EOTECH SAS, Francie).
4) Hodnocení nežádoucích reakcí kůže
Nežádoucí účinky byly kontrolovány při každé návštěvě dotazníkem a pozorováním. Při hodnocení byly subjektivní parametry klasifikovány jako svědění, píchání, lechtání, pálení, štípání,ztuhlost a napjatost a objektivní parametry byly klasifikovány jako erytém, edém, šupiny a papule.
5) Statistická analýza
Data byla analyzována pomocí softwaru SPSS®. Statistická významnost rozdílů mezi časovými body byla stanovena pomocí analýzy opakovaných měření; p-hodnota<0.05 byl považován za statisticky významný. Míra změny ( v procentech ) od základní hodnoty byla vypočtena následovně:
Míra změny=((po výchozí léčbě)/výchozí hodnota)×100 procent
