Proti stárnutí a inhibiční účinky tyrosinázy butanolového extraktu z květu Cassia Fistula, část 1

Abstraktní

Pozadí: Přírodní produkty vyrobené z rostlinných zdrojů se používají v různých kosmetických aplikacích jako zdroj výživy a jako bělící činidlo. Květy Cassia fistula L, čeledi Fabaceae, byly používány jako tradiční lék na kožní onemocnění a hojení ran a bylo hlášeno, že mají antioxidační vlastnosti. Byl zkoumán účinek extraktu z květů C. fistula proti stárnutí na fibroblasty lidské kůže.

Glykosid cistanche může také zvýšit aktivitu SOD v srdeční a jaterní tkáni a významně snížit obsah lipofuscinu a MDA v každé tkáni, účinně zachycovat různé reaktivní kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atd.) a chránit před způsobeným poškozením DNA. OH-radikály. Cystanche fenylethanoidové glykosidy mají silnou schopnost vychytávání volných radikálů, vyšší redukční schopnost než vitamín C, zlepšují aktivitu SOD v suspenzi spermií, snižují obsah MDA a mají určitý ochranný účinek na funkci membrány spermií. Polysacharidy Cistanche mohou zvýšit aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytech a plicních tkáních experimentálně senescentních myší způsobených D-galaktózou, stejně jako snížit obsah MDA a kolagenu v plicích a plazmě a zvýšit obsah elastinu. dobrý čisticí účinek na DPPH, prodlužuje dobu hypoxie u senescentních myší, zlepšuje aktivitu SOD v séru a oddaluje fyziologickou degeneraci plic u experimentálně senescentních myší Experimenty prokázaly, že Cistanche má dobrou antioxidační schopnost s buněčnou morfologickou degenerací a má potenciál být lékem k prevenci a léčbě nemocí stárnutí kůže. Zároveň má echinakosid v Cistanche významnou schopnost vychytávat volné radikály DPPH a dokáže vychytávat reaktivní formy kyslíku, bránit volnými radikály indukované degradaci kolagenu a má také dobrý opravný účinek na poškození aniontů volnými radikály thyminu.

Klikněte na Výhody Desert Cistanche

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Metody: Extrakce květů C. fistula butanolem byla dokončena a účinné látky byly klasifikovány. Cytotoxicita fibroblastů byla hodnocena testem SRB pro výběr netoxických dávek pro další experimenty. Syntéza kolagenu a kyseliny hyaluronové (HA) pak byla měřena pomocí kolagenového kitu a ELISA, v daném pořadí. Kromě toho byla také hodnocena aktivita enzymů, včetně kolagenázy, matrixmelloproteinázy-2 (MMP-2) a tyrosinázy.

Výsledek: Bylo zjištěno, že extrakt z květů neovlivňuje růst kožních fibroblastů (IC50 > 200 ug/ml). Výsledky ukázaly, že extrakt z květů významně zvýšil syntézu kolagenu a HA v závislosti na dávce. Extrakt z květů (50–200 ug/ml) také významně inhiboval aktivitu kolagenázy a MMP-2. Kromě toho by tento květový extrakt mohl inhibovat aktivitu tyrosinázy, která způsobuje hyperpigmentaci, která vyvolává stárnutí pokožky.

Závěry: Extrakt z květu C. fistula vykazoval preventivní účinek při použití pro účely proti stárnutí ve fibroblastech lidské kůže a může být vhodnou volbou pro kosmetické produkty, jejichž cílem je poskytnout bělící účinky a které jsou označeny jako produkty péče o pleť obličeje proti stárnutí .

Klíčová slova: Kolagenáza, Syntéza kolagenu, Glykosaminoglykan, Kyselina hyaluronová, Matrix metaloproteináza

Pozadí

Stárnutí kůže je komplikovaná biochemická progrese vyplývající z mnoha individuálních vnitřních a vnějších faktorů, jako je věk, hormony a expozice UV záření [1]. K progresi dochází v epidermálních a dermálních vrstvách a souvisí především s degradací extracelulární matrix (ECM) [2]. Enzymy podílející se na degradaci ECM jsou matricové metaloproteinázy (MMP), jako jsou želatinázy (MMP-2) a kolagenáza [3]. Kůže ztrácí svou pevnost v tahu vlivem degradace ECM působením MMP. Při tomto procesu dochází ke vrásnění kůže a také výrazně vzniká drsnost a suchost spolu s určitými pigmentovými abnormalitami, jako je hypo- nebo hyperpigmentace [2, 4]. Pro léčbu hyperpigmentace byly zkoumány inhibitory tyrosinázy. Tyrosináza je enzym omezující rychlost, který přeměňuje tyrosin na melanin [5]. Inhibitory tyrosinu tak hrají důležitou roli jako látky zesvětlující pokožku [6], zatímco syntéza kyseliny hyaluronové (HA) reguluje hydrataci pokožky a výskyt vrásek. HA, nesulfatovaný glykosaminoglykan (GAG), se skládá z opakujících se jednotek disacharidů včetně kyseliny D-glukuronové a N-acetyl-Dglukosaminu [7]. HA také reguluje reparaci tkání, včetně zesílení reakce imunitního systému aktivací zánětlivých buněk a v reakci na poškození fibroblastů [8–10].

Přírodní produkty vyrobené z rostlinných zdrojů, jako je Glycyrrhiza glabra [11] nebo zelený čaj [12], byly používány v kosmetických aplikacích jako zdroj výživy a jako bělící činidlo. Značné množství důkazů poukázalo na příznivé účinky orálně nebo lokálně podávaných fytochemikálií z rostlinných extraktů, zejména na zlepšení stavu kůže. Některé příklady příznivých účinků jsou, že stárnutí kůže a záněty kůže mohou být sníženy. C. fistula (zlatý déšť), čeleď Fabaceae, se vyskytuje v mnoha asijských zemích, jako je Thajsko, Čína, Myanmar a Indie. V předchozích studiích bylo zjištěno, že extrakt z květu C. fistula má antioxidační, protirakovinné, antibakteriální, antifungální a antidiabetické vlastnosti [13, 14]. Je známo, že účinek C. fistula v ajurvédské medicíně se podílí na léčbě různých poruch, včetně kožních onemocnění, lepry, hematemezy, svědění a cukrovky [15, 16]. Různé části C. fistula vykazují farmakologické vlastnosti [17]. Květiny, semena, ovoce a dužina se používají k léčbě kožních onemocnění včetně lepry [18]. Dřeň byla uznávána pro své antidiabetické vlastnosti [15] a byla používána v toniku, který se používal při léčbě dny a revmatismu [19]. Listy a zralé lusky se tradičně používaly jako projímadlo [20, 21]. Fenoly a flavonoidní fytochemikálie C. fistula byly také popsány jako užitečné při léčbě kožních onemocnění [14]. Proto se v této studii zajímáme o role extraktu z květů C. fistula v kosmeceutických aplikacích. Byly zkoumány preventivní účinky degradace ECM spolu s enzymy stárnutí kůže, které zahrnují aktivity kolagenázy a MMP-2 a také tyrosinázy. Navíc byla stanovena syntéza kolagenu a HA.

Metody

Chemikálie a činidla

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), DQ želatina a penicilin-streptomycin byly dodány od Gibco (Grand Island, NY, USA). Fetální bovinní sérum (FBS) bylo dodáno od Thermo Scientific (USA). Sada Sirius Red/Fast Green Collagen Stained Kit byla zakoupena od Chondrex, Inc. (Redmond, WA, USA). Sulforhodamin B činidlo, kyselina hyaluronová a houbová tyrosináza byly získány od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Rostlinné materiály

Květy C. fistula byly získány z Lampang Herb Conservation, provincie Lampang, Thajsko. Číslo vzoru voucheru (023197) bylo certifikováno Wannaree Charoensup, botanikem v herbáři Flora of Thailand, Farmaceutická fakulta, Chiang Mai University, Thajsko.

Příprava extraktu z květu Cassia fistula

Květy C. fistula se sušily ve vzdušné místnosti a následně se 500 g sušených květů jemně rozemlelo na prášek. Poté byl prášek namočen v 50% ethanolu a poté třepán při 70 otáčkách za minutu po dobu 24 hodin. Po 24 hodinách byly vzorky filtrovány přes filtrační papír, aby se oddělil zbytek. Zbytek byl namočený v 50% ethanolu a třepán při 70 otáčkách za minutu po dobu 24 hodin a tento krok byl opakován 2krát. Filtrované vzorky byly spojeny dohromady a odpařeny na rotační vakuové odparce (BUCHI, Švýcarsko), aby se získaly vodné frakce. K vodné frakci byl přidán hexan v poměru hexan 2:1. Vzorky se protřepaly a nechaly se oddělit po dobu 30 minut. Vzorky byly rozděleny do dvou frakcí, kterými byly hexanové a vodné frakce. Poté se shromáždila vodná frakce a přidalo se 10 procent aktivního uhlí po dobu 30 minut za mírného míchání při teplotě místnosti. Vzorky byly filtrovány přes filtrační papír a celit, aby se oddělilo aktivní uhlí. Vzorky byly smíchány s nasyceným butanolem v poměru nasyceného butanolu 2:1 a vzorky byly ponechány separovat po dobu 12 hodin a tento krok byl opakován 3x. Vzorky byly rozděleny do dvou frakcí, které zahrnovaly vodní a butanolovou frakci. K butanolovým frakcím byla dále přidána voda do stejného objemu a tyto frakce byly ponechány odpařit pomocí rotační vakuové odparky. Odpařené vzorky byly lyofilizovány, aby se získal prášek extraktu z květů C. fistula.

Kvantifikace celkového obsahu fenolů v extraktu z květu C. fistula pomocí UV-viditelného spektrofotometru

Celkový obsah fenolů v extraktu z květu C. fistula byl stanoven pomocí Folin-Ciocalteu testu. Stručně, 0,4 ml extraktu z květu C. fistula bylo smícháno s 0,3 ml 10 procenta Folin-Ciocalteauova činidla a inkubováno ve tmě při pokojové teplotě po dobu 3 minut . Poté bylo přidáno 0,3 ml roztoku uhličitanu sodného a roztok byl dále inkubován ve tmě při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Absorbance byla hodnocena při 765 nm pomocí UV-viditelného spektrofotometru. Byla vypočtena koncentrace celkového obsahu fenolů a porovnána se standardní křivkou pro kyselinu galovou (GA) při 0–20 ug/ml. Celkový obsah fenolů byl uváděn v miligramech ekvivalentů GA na gram C. fistula. extrakt z květů (mg GAE/g extraktu).

Kvantifikace fenolických sloučenin v extraktu květu C. fistula pomocí HPLC analýzy

Různé typy fenolických sloučenin v extraktech květů C. fistula byly analyzovány pomocí HPLC analýzy a poté byly porovnány se standardní kyselinou galovou, katechiny, kyselinou protokatechovou, kyselinou vanilovou, kyselinou chlorogenovou, kyselinou ferulovou a kyselinou kumarovou. Květinové extrakty byly rozpuštěny v 50procentním ethanolu a byly dále hodnoceny pomocí HPLC (Agilent Technologies, CA, USA) za použití kolony C18 s reverzní fází (WATER, MA, USA). Mobilní fáze sestávala z methanolu (A) a 0,1% kyseliny trifluoroctové (TFA) ve vodě (B) za podmínek gradientu. Průtok byl nastaven na 1,0 ml/min a detekční vlnová délka byla zaznamenána při 280 UV detektorem. Byly vypočteny hladiny koncentrací fenolických sloučenin a porovnány se standardní křivkou s ohledem na standardní koncentrace a plochy píku (mg/g extraktu).

Kvantifikace celkového obsahu flavonoidů v extraktu z květu C. fistula pomocí kolorimetrického testu

Celkový obsah flavonoidů byl stanoven modifikovaným kolorimetrickým testem chloridu hlinitého (AlCl3), jak bylo popsáno dříve [22]. Stručně, 0,25 ml květového extraktu bylo smícháno s 0,125 ml 5% dusitanu sodného (NaN02) a roztok byl inkubován po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Poté bylo do směsi přimícháno 0,125 ml 10% AlCl3 a směs byla udržována ve tmě po dobu 5 minut. Poté byl přidán 1 ml hydroxidu sodného (NaOH) a roztok byl inkubován po dobu 15 minut při teplotě místnosti ve tmě. Absorbance byla měřena při 510 nm pomocí UV-viditelného spektrofotometru. Celkový obsah flavonoidů byl vypočten a porovnán se standardními hodnotami katechinů a vyjádřen jako mg ekvivalentu katechinu na gram extraktu (mg CE/g extraktu).

Buněčné kultury

Primární lidské kožní fibroblasty byly asepticky izolovány z břišní jizvy po chirurgickém zákroku zahrnujícím porod císařským řezem na chirurgickém oddělení nemocnice CM Maharaj, Chiang Mai University (Chiang Mai, Thajsko) (kód studie: BIO-2558-03549 schváleno společností Medical Etický výbor pro výzkum, Univerzita Chiang Mai). Tuk byl odstraněn z výchozího materiálu a byl namočený v DMEM obsahujícím anti-penicilin a streptomycin. Poté byla kůže ponořena do DMEM obsahujícího 1 procento proteázy (Dispase, Gibco, Grand Island, NY, USA) na 48 hodin při 4 stupních. Epidermální vrstvy byly odstraněny a normální fibroblasty byly izolovány z dermis. Fibroblasty byly kultivovány v DMEM doplněném 10 procenty FBS, 2 mM L-glutaminu, 50 U/ml penicilinu a 50 ug/ml streptomycinu. Buňky byly udržovány v 5% CO2 zvlhčeném inkubátoru při 37 stupních.

Test životaschopnosti buněk

Test buněčné životaschopnosti extraktu z květu C. fistula proti buňkám kožních fibroblastů byl měřen pomocí testu sulforhodaminu B (SRB), jak bylo popsáno dříve [23]. Stručně řečeno, buňky (8x103 buňky/jamka) byly nasazeny na 96-jamkovou destičku a inkubovány při 37 stupních, 5 % CO2 po dobu 24 hodin. Poté byly buňky ošetřeny s nebo bez různých koncentrací (0–200 ug/ml) extraktu z květu C. fistula po dobu 48 hodin. Po 48 hodinách byla k buňkám přidána 10% (w/v) kyselina trichloroctová (TCA) a buňky byly poté inkubovány při 4 stupních po dobu 1 hodiny. Médium bylo odstraněno a buňky byly opláchnuty pomalu tekoucí vodou z vodovodu. Do každé jamky byl přidán 0,057 procent (w/v) roztok SRB (100 ul) a buňky byly inkubovány po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Roztok SRB byl odstraněn a poté byly buňky 4krát promyty 1% (v/v) kyselinou octovou a byly ponechány uschnout při teplotě místnosti. Barvivo bylo rozpuštěno v 10 mM roztoku Tris báze (pH 10,5) a absorbance byla měřena při 510 nm pomocí čtečky mikrodestiček.

Test syntézy kolagenu

Celkový intracelulární kolagen ve fibroblastových buňkách byl stanoven pomocí Sirius Red/Fast Green Collagen Stained Kit (Chondrex, Inc., Redmond, WA, USA) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, kožní fibroblastové buňky byly naočkovány na 24jamkové destičky po dobu 24 hodin při 37 stupních, 5 procentech CO2. Poté byly buňky předem ošetřeny médiem DMEM bez séra po dobu 24 hodin. Médium bylo odstraněno a buňky byly poté inkubovány s nebo bez extraktu z květu C. fistula (0-150 ug/ml) po dobu 48 hodin. Po 48 hodinách bylo kultivační médium odstraněno. Poté byly buňky promyty PBS a fixovány Kahle fixativem po dobu 10 minut. Fixační činidlo bylo odstraněno a buňky byly promyty PBS. Do každé jamky byl přidán roztok barviva Sirius Red/Fast Green a vzorky byly inkubovány po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Barvivo bylo odstraněno a buňky byly čtyřikrát promyty DI vodou nebo dokud nebyla kapalina bezbarvá. Nakonec byl přidán extrakční pufr a byla měřena absorbance při 540 nm a 605 nm pomocí UV-viditelného spektrofotometru.

Test aktivity kolagenázy

Aktivita kolagenázy byla měřena pomocí modifikovaného fluorogenního DQ™-želatinového testu, jak bylo popsáno dříve [24]. Stručně, různé koncentrace extraktu z květů C. fistula (0–200 ug/ml) byly přidány do 96jamkových destiček. Do každé jamky byla přidána jedna U/ml kolagenázy (100 ul/jamka). Poté bylo přidáno 15 ug/ml želatiny (DQ želatina) a směsi byly inkubovány po dobu 10 minut. Rychlost proteolýzy byla stanovena měřením absorbance ve 2minutových intervalech po dobu 20 minut za použití čtečky mikrodestiček při excitační vlnové délce 485 nm a emisní vlnové délce 528 nm. Aktivita enzymu byla odhadnuta zkoumáním sklonu lineární regrese mezi časem a absorbancí po dobu 2-6 min.

Test aktivity MMP-2

Aktivita MMP{{0}} byla stanovena želatinovou zymografií, jak bylo popsáno dříve [25]. Fibroblastové buňky byly kultivovány v médiu bez séra DMEM po dobu 24 hodin. Poté byl odebrán kultivační supernatant. Kultivační supernatant byl vystaven 10 procentním polyakrylamidovým gelům obsahujícím 0,1 procenta w/v želatiny za neredukujících podmínek. Gely byly dvakrát promyty 2,5 procenty v/v Tritonu X-100 po dobu 30 minut při teplotě místnosti, aby se odstranil SDS. Deska gelu byla nařezána na plátky, které odpovídaly drahám, a poté byly plátky vloženy do různých nádrží a inkubovány s aktivačním pufrem (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) obsahujícím různé koncentrace C. extrakt z květu píštěle (0–200 ug/ml) při 37 stupních po dobu 18 hodin. Poté byl proužek gelů promyt a obarven Coomassie Brillant Blue R (0,1 procenta w/v) a poté byl odbarven ve 30 procentech methanolu a 10 procentech kyseliny octové. Aktivita MMP-2 se objevila jako jasný pruh na modrém pozadí. Digesční pásy byly kvantifikovány programem Image J.

Test syntézy kyseliny hyaluronové (HA) pomocí ELISA

Účinek extraktu z květu C. fistula na syntézu HA byl stanoven pomocí soupravy ELISA, jak bylo popsáno dříve [26]. Fibroblastové buňky (5.0 × 104 buňky/jamka) byly nasazeny na 24-jamkové destičky po dobu 24 hodin při 37 stupních, 5 % CO2. Buňky byly předem ošetřeny v médiu bez séra po dobu 6 hodin a poté byly ošetřeny různými koncentracemi extraktu z květů C. fistula (0–200 ug/ml) nebo bez nich po dobu 48 hodin. Kultivační médium bylo shromážděno a syntéza HA byla měřena pomocí ELISA. Absorbance byla měřena při 450 a 570 nm pomocí čtečky mikrodestiček. Byla vypočtena koncentrace HA v kultivovaném supernatantu získaném z ošetřených fibroblastových buněk a porovnána se standardní křivkou HA.

Test inhibice tyrosinázy

Test inhibice tyrosinázy byl stanoven tak, jak bylo popsáno dříve [27]. Různé koncentrace extraktu z květu C. fistula byly přidány do 96-jamkové destičky. Reakce byla provedena v sodném pufru (pH 6,4) obsahujícím 100 U/ml houbové tyrosinázy. K reakční směsi byl přidán substrát L-DOPA (1 mM) a směs byla poté inkubována po dobu 10 minut při teplotě místnosti. Změna absorbance při 490 nm byla měřena každých 1,5 minuty po dobu 15 minut pomocí čtečky mikrodestiček. Procento inhibice tyrosinázy bylo vypočteno podle následujícího vzorce:

Test antioxidační aktivity

Antioxidační aktivita extraktu z květu C. fistula byla stanovena pomocí aktivity volných radikálů 1, 1-difenyl-2-pikrylhydrazyl (DPPH), jak bylo popsáno dříve [28]. V methanolu byly připraveny různé koncentrace extraktu z květů (0–100 ug/ml). 1 ml 0,002 procenta DPPH byl přidán do 1 ml roztoku květového extraktu a směs byla udržována ve tmě po dobu 30 minut. Absorbance byla měřena při 517 nm pomocí spektrofotometru. Procento inhibice bylo vypočteno a porovnáno se standardním vitamínem E (1–100 ug/ml) pomocí následujícího vzorce:

Antioxidační aktivita extraktů z květů C. fistula byla potvrzena pomocí testu ABTS, jak bylo popsáno dříve [29]. Radikálový kationt ABTS [2,2'-azino-bis (ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina)] byl připraven smícháním 7 mM zásobního roztoku ABTS s 2,45 mM persíranem draselným (K2S2O8) (1/1, v/v). Směs byla inkubována ve tmě po dobu 12–16 hodin, dokud nebyla reakce dokončena. Test byl proveden s 990 μl roztoku ABTS a 10 μl extraktu z květů (0–4 ug/ml). Po 6 minutách byla okamžitě zaznamenána absorbance při 734 nm pomocí spektrofotometru. Procento inhibice ABTS aktivity květového extraktu bylo vypočteno pomocí následující rovnice:

Statistická analýza

Všechna data jsou prezentována jako průměr ± standardní odchylka (SD) hodnoty. Statistická analýza byla analyzována softwarem Prism verze 6.{1}} pomocí jednocestné analýzy ANOVA s Dunnettovým testem. Statistická významnost byla stanovena při * p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0,001 nebo **** p < 0,0001.

Výsledek

Fytochemická charakterizace extraktu z květů C. fistula

Po kroku zahrnujícím lyofilizaci vzorků byl extrakt z květu C. fistula zvážen a dále podroben fytochemickým a biologickým studiím. 18.08 g extraktu z květu C. fistula bylo získáno z 500 g suroviny a procentní výtěžek květového extraktu byl 3,62. HPLC fingerprint extraktů květů C. fistula byl stanoven pomocí HPLC analýzy (obr. 1). HPLC profil, který ukázal pík fenolických sloučenin, byl označen z hlediska jednotlivých složek v každém retenčním čase. Charakterizace fenolických sloučenin extraktu z květů C. fistula je uvedena v tabulce 1. Celkový obsah fenolů v extraktu z květů byl 275,32 ± 14,21 mg GAE/g extraktu. Bylo zjištěno, že deriváty kyseliny hydroxybenzoové, včetně kyseliny vanilové a kyseliny protokatechuové, jsou {{20}},95 ± 0.09 a 2,56 ± 0. 42 mg/g extraktu, v daném pořadí, zatímco kyselina gallová byla zaznamenána při {{30}},60 ± 0,02 mg/g extraktu. Deriváty kyseliny hydroxyskořicové, včetně kyseliny kumarové, kyseliny ferulové a kyseliny chlorogenové, byly detekovány při 0,39 ± 0,08, 0,80 ± 0,09 a 0,83 ± 0,03 mg/g extraktu, v daném pořadí. Obsah flavonoidů byl 27,62 ± 3,56 mg CE/g extraktu. Katechin jako derivát flavonolu byl naměřen na 1,10 ± 0.00 mg/g extraktu.

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】