Deriváty anastatinu zmírňují ischemicko-reperfuzní poškození myokardu díky antioxidačním vlastnostem

Pro další informace kontaktujtetina.xiang@wecistanche.com

Abstraktní:(±)-Anastatiny A a B jsou flavonoidy izolované z Anastatica hierochuntica. V předchozí studii bylo navrženo 24 nových di- a trisubstituovaných derivátů anastatinů a byly vyhodnoceny jejich předběžné antioxidační aktivity. V této studii byl dále studován protektivní účinek ischemicko-reperfuze myokardu (I/R) a systematická antioxidační kapacita 24 derivátů. Sloučenina 13 byla nejúčinnější ze všech studovaných sloučenin, což zvýšilo přežití buněk H9c2 na 80,82 procent. Antioxidační schopnost sloučeniny 13 byla hodnocena jako antioxidační síla redukující železo, 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonová kyselina) pohlcující radikály a 2,2-difenyl{ {20}}pikrylhydrazylové testy. Bylo pozorováno, že sloučenina 13 významně redukovala infarktové oblasti a zlepšila histopatologické a elektrokardiogramové změny u krys s poraněním myokardu I/R. Sloučenina 13 navíc snížila míru úniku sérové ​​laktátdehydrogenázy, kreatinkinázy a malonyldialdehydu z tkání myokardu potkana a zvýšila hladinu aktivity glutathionu a superoxiddismutázy poI/R poranění myokarduu krys. Souhrnně jsme došli k závěru, že sloučenina 13 má silné kardioprotektivní účinky proti poškození myokardu I/R jak in vitro, tak in vivo díky svým rozsáhlým antioxidačním aktivitám.

Klíčová slova: deriváty flavonoidů; buňky H9c2; hypoxie/reoxygenace; kardioprotektivní účinky

Kliknutím sem získáte další informace o produktu

1. Úvod

Ischemická choroba srdeční (ICHS) je celosvětově hlavní příčinou úmrtí [1]. Včasné obnovení průtoku krve může účinně zlepšit klinický výsledek onemocnění; nicméně reperfuze není bez rizika vzhledem k rozsahu buněčného poškození způsobeného samotnou reperfuzí. Proto je nesmírně důležité vyvinout účinné terapeutické strategie proti ischemicko-reperfuznímu (I/R) poškození myokardu [2]. Mechanismus I/R poranění myokardu je velmi komplikovaný; zahrnuje apoptózu, oxidační stres [3], přetížení vápníkem [4] a zánět [5].Oxidační stresmůže vést k apoptóze prostřednictvím různých signálních transdukčních drah, včetně signálem regulované kinázy (ERK), c-Jun amino-terminální kinázy (JNK), aktivace p53 (nádorový protein p53) a varianty p66shc. Navíc nadměrná produkce reaktivních forem kyslíku (ROS) může způsobit nevratné poškození buněčných membrán a buněčných molekul, jako je DNA, nukleové kyseliny, protein, lipidy, a spustit řetězové reakce, které dále poškozují tkáň myokardu. Oxidační stres [6], který je způsoben nerovnováhou mezi tvorbou volných radikálů a vychytáváním ROS, hraje důležitou roli v patogenezi I/R poranění I. Proto jsou v managementu velmi zvažovány strategie, které chrání myokard před oxidačním stresem. I/R poranění myokardu. Proto jsou strategie založené na antioxidantech díky jejich potenciální schopnosti pohlcovat volné radikály prospěšné při léčbě I/R poškození.

V klinických studiích se antioxidanty používají ke sníženíI/R poranění myokarduse dělí hlavně na dva typy: enzymy a neenzymy. Enzymy jako kataláza a glutathionperoxidáza snižují koncentraci peroxidu vodíku, aby se zabránilo poškození buněk; neenzymatické antioxidanty, jako je vitamín E, vitamín C, karoten atd., oslabují reakci tkáně na oxidační stres, aby se snížilo poškození tkáně a podpořila se funkční oprava. Aplikace obou má však v současnosti určitá omezení. Velká molekulová hmotnost enzymových přípravků není příznivá pro absorpci [8]. Existují také určité problémy se stabilitou neenzymů, což vede ke špatné stabilitě léčiv, a proto snadno oxidují [9].Flavonoidy, jako druh neenzymatických antioxidantů, se uvádí, že mají řadu silných vlastností, včetně antioxidační, protirakovinné, antiapoptotické a kardiovaskulární ochrany [10]. Zabraňují tvorbě vysoce reaktivních oxidů a inhibují oxidační reakce vychytáváním ROS, jako jsou vodíkové radikály a peroxydusitan. Anastatiny A a B [11] jsou flavonoidy s hepatoprotektivní aktivitou. Anastasius A a B jsou aktivní složky v Anastatica hierochuntica (podtyp Anastatica, čeleď Brassicaceae). V současné době existuje jen velmi málo zpráv o chemické syntéze a strukturálních modifikacích anastatinů A a B. V roce 2003 byly izolovány aktivní sloučeniny z Anastatica hierochuntica a bylo prokázáno, že mají hepatoprotektivní účinky proti cytotoxicitě vyvolané D-galaktosaminem v primárních kultivovaných myších hepatocytech. Nakashima a Eman také prokázali, že sloučeniny vykazují in vitro antioxidační a protirakovinné aktivity. Farmakologické účinky anastatinů A a B a jejich derivátů, stejně jako postupy jejich syntézy, však zůstávají nejasné. Proto jsme se zaměřili na syntézu anastatinů A a B a některých jejich derivátů a vyhodnocení jejich antioxidační aktivity při hypoxii/reoxygenace(H/R) model, který je účinný pro studium I/R poranění myokardu [12].

V předchozí studii jsme syntetizovali anastatiny A a B a jejich analogy a hodnotili jsme jejich antioxidační schopnosti pomocí modelu buněčné kultury oxidačního poškození vyvolaného H2O2 (peroxidem vodíku)13. Naše předchozí výsledky ukázaly, že anastatiny A a B mají silné hepatoprotektivní aktivity, které se zdají souviset s jejich antioxidačními schopnostmi.

V této studii byly syntetizovány anastatiny A a B a 24 jejich derivátů a hodnoceny na antioxidační schopnosti pomocí testů na snížení síly a radikálů. Kromě toho byl k vyhodnocení kardioprotektivních účinků sloučenin použit jednoduchý H9c2 buněčný model H/R a krysí model poškození myokardu I/R.

2. Výsledky

2.1. Založení modelu H/R

Koncentrace ošetření Na2S, O4 byla hodnocena, jak je znázorněno na obrázku 1A, a míra přežití buněk H9c2 byla snížena se zvyšující se koncentrací Na2S204. Pod 4 mM Na, S, Oa se životaschopnost buněk snížila na méně než 50 procent (13,7,25 a 43,4 procent, v tomto pořadí v době reoxygenace 2,1 a 0 h) a úroveň snížení životaschopnosti buněk byla nižší. Proto byla k napodobení hypoxické léčby použita 4 mM koncentrace Na2S204. Obrázek 1B ukazuje, že ošetření 4 mM Na2S204 po dobu 2 h bez reoxygenace (0 h) významně snížilo životaschopnost buněk a zůstalo stabilní. Za podmínek 4 mM koncentrace NazS2O4 po dobu 2 hodin napodobování hypoxie, 2 hodiny reoxygenace snížily míru přežití buněk na 17,37 procent (obrázek 1C). Jak je jasně ukázáno na obrázku 1D, 10 μM resveratrolu zvrátilo sníženou životaschopnost buněk způsobenou H/R, která byla účinnější než stejná koncentrace kyseliny gallové (74,34 vs. 60,44 procent pro kyselinu galovou).

V důsledku toho byl vytvořen model hypoxie/reoxygenace s použitím Na2S, O4 v konečné koncentraci 4 mM po dobu 2 hodin napodobování hypoxie, po které následovala kultivace v normálním DMEM (Dulbeccova modifikace Eaglova média)/vysoká hladina glukózy, aby se napodobilo poškození reoxygenací. . Jako pozitivní kontrola byl použit resveratrol v konečné koncentraci 10 μM.

2.2. Anastatiny a jejich derioatioes zlepšují životaschopnost buněk H9c2 vystavených léčbě H/R

Nejprve jsme zkoumali účinky anastatinů A a B (obrázek 2A, B) a jejich derivátů na životaschopnost buněk H9c2 v MTT(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1){{ 10}}, 5-di-fenyltetrazoliumromidový test [13]. Sloučeniny 20a, 21a, 22a, 20b, 22b, 20c, 20c', 21c, 22c, 10 a 11 nebyly významně cytotoxické pro buňky H9c2 (obrázek 3A, B, tabulka S2). Anastatiny A a B, jejich deriváty a resveratrol (pozitivní kontrola) zvrátily poškození buněk vyvolané hypoxií (obrázek 4). V modelové skupině byla životaschopnost buněk snížena na 20,31 procenta, která byla zvýšena na 82,68 procenta pomocí resveratrolu a anastatin A a sloučeniny 22b, 22c, 24b, 24c,13 a 14 zvýšily míru přežití buněk na více než 70 procent ( 71,49,71.00,76,50, 73,24, 77,57, 80,82 a 77,13 procenta). Proto sloučenina 13 (obrázek 2C) měla nejsilnější ochranný účinek mezi deriváty anastatinů před poškozením H/R a byla použita v následujících experimentech.

2.3. Sloučenina 13 zmírňuje poškození buněk vyvolané H/R a oxidační stres

Aby bylo možné prozkoumat antioxidační kapacitu sloučeniny, třioxidační stresK hodnocení antioxidační kapacity sloučenin byly vybrány indikátory LDH (laktátdehydrogenáza), GSH (L-Glutathion) a SOD (superoxiddismutáza). LDH je stabilní cytoplazmatický enzym přítomný v buňkách myokardu, který se rychle uvolňuje z buňky do buněčného kultivačního média po poškození membrány myokardu. Čím závažnější je poranění, tím vyšší je hladina LDH v kultivačním médiu. Obrázek 5A ukazuje, že 2 hodiny hypoxie následované 2 hodinami reoxygenace významně zvýšily uvolňování LDH (478,98 U/L oproti 55,84 U/L ve slepé skupině, p<0.001), which="" was="" inhibited="" by="" resveratrol="" (284.07="" u/l="" vs.="" the="" model="" group=""><0.01) and="" compound="" 13(276.61="" u/l="" vs.the="" model="" group,=""><0.001).gsh can="" act="" as="" a="" hydrogen="" donor="" for="" glutathione="" catalase="" (cat),="" eliminating="" o2-="" and="" its="" derivatives="" in="" the="" organism,="" thereby="" cells="" are="" protected="" from="" oxidant="" damage.="" additionally,="" sod="" can="" catalyze="" the="" disproportionation="" of="" superoxide="" anions="" and="" protect="" cells="" from="" damage.="" as="" shown="" in="" figure="" 5b,="" c,="" compound="" 13="" significantly="" increased="" gsh="" release="" and="" sod="" activity=""><0.01）. it="" increased="" gsh="" level="" to="" 39.93="" μmol/gprot="" which="" was="" higher="" than="" the="" level="" in="" the="" model="" group="" （18.2="" μmol/gprot）="" but="" slightly="" lower="" than="" that="" in="" the="" resveratrol="" group.="" additionally,="" it="" reversed="" h/r-induced="" reduction="" in="" sod="" activity="" by="" increasing="" sodlevel="" from="" 12.00="" u/mgprot="" to="" 22.98="" u/mgprot.="" these="" findings="" demonstrate="" that="" compound="" 13="" has="" a="" protective="" effect="" on="" h9c2="" cells="" subjected="" to="" h/r="">

2.4. Antioxidační kapacita sloučeniny 13

Vitamin C(Vc) was used as an antioxidant control in order to evaluate the antioxidant effects of resveratrol and compound 13 intuitively. FRAP assay was used to evaluate the reducing power of the compound that can transfer ions from Fe3+ into Fe2+ to determine the antioxidant capacity of compounds. The results of the experiment showed that the reducing power of compound 13 was 354.80 mg/mmol, significantly stronger than the values obtained for the positive control Vc (127.47 mg/mmol) and resveratrol (261.91 mg/mmol) (Figure 6A).ABTS (2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)and DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) are stable free radicals insolvent, but when a radical scavenger is added to the solvent, the result is a reduction in the number of free radicals and the degree of reduction in the number of free radicals is directly proportional to the antioxidant capacity. Figure 6B, C show the ABTS and DPPH radical scavenging abilities of compound 13. The results indicate that compound 13 had the strongest scavenging activity on ABTS and DPPH with EC50 values of 1.38 and 0.07 mM, respectively. The antioxidant capacities of the compounds tested in all three antioxidant assays followed the same trend: compound 13>resveratrol. Proto může být antioxidační kapacita sloučeniny 13 vyšší než u jiných typických antioxidantů.

2.5. Účinky derivátu anastatinu 13 na I/R poranění myokardu u potkanů

2.5.1. Účinky sloučeniny 13 na oxidační stres a antioxidační enzymové aktivity

Úroveň poškození myokardu byla hodnocena detekcí markeru oxidativního stresu a aktivit antioxidačních enzymů. Byly hodnoceny účinky sloučeniny 13 na aktivitu MDA (malondialdehyd) v tkáni myokardu, stejně jako hladiny LDH, CK (kreatinkinázy), GSH a SODin v séru. Jak je znázorněno na obrázku 7, poškození I/R vedlo ke zvýšení hladin LDH (obrázek 7A) a CK (obrázek B) a k významnému snížení aktivit GSH (obrázek 7C) a SOD (obrázek 7D) (p<0.001). the="" level="" of="" mda(figure="" 7e)increases="" after="" i/r="" injury,="" which="" is="" a="" critical="" diagnostic="" marker="" of="" i/r="" injury.="" however,="" pretreatment="" with="" a="" positive="" control="" drug="" and="" different="" concentrations="" of="" compound="" 13="" significantly="" alleviated="" these="" injuries.="" ldh="" activity="" obtained="" for="" the="" i/r="" model="" group="" was="" 771.37="" u/ml,="" which="" was="" remarkably="" decreased="" to="" 416.129="" u/ml="" under="" resveratrol="" treatment.="" in="" the="" high-and="" low-dose="" 13="" groups,="" ldh="" activity="" decreased="" to="" 408.05="" and="" 462.81="" u/ml,="" respectively="" similar="" trends="" were="" observed="" for="" other="" myocardial="" injury="" markers,="" including="" the="" level="" of="" ck,="" gsh,="" sod,="" and="" mda="" release.="" these="" results="" indicated="" that="" compound="" 13="" exerted="" protective="" effects="" against="" oxidative="" stress-induced="" i/r="" injury="" in="" a="" dose-dependent="">

2.5.2. Účinky sloučeniny 13 na změny elektrokardiogramu (EKG) a srdeční frekvenci

Typické změny EKG (elektrokardiogramu) vyvolané I/R poraněním myokardu jsou znázorněny na obrázku 8. Ve srovnání s normálním EKG (obrázek 8A) může I/R poškození myokardu způsobit zvýšení amplitudy ORS (část elektrokardiografické vlny) (obrázek 8B); QRS vlna a fúze ST vlny (obrázek 8C); elevace segmentu ST (interval mezi vlnou S a vlnou T) (obrázek 8D); a inverze ST segmentu (obrázek 8E). Po 15 minutách ligace LAD byla amplituda QRS významně zvýšena z přibližně 0,5 mV na 1,2 mV v modelové skupině (obrázek 9A), zatímco ve všech léčených skupinách bylo pozorováno nižší zvýšení amplitudy QRS (od kolem 0,4 mV až 1, 0,8 a 0,6 mV pro skupinu resveratrolu, nízké dávky 13 a vysoké dávky 13, v tomto pořadí) (obrázek 9B-D ). Navíc byl podobný trend pozorován při ligaci 30 min. Během reperfuze se amplituda QRS začala snižovat; vlna QRS v modelové skupině však zůstala nejvyšší za celé období. Po 20 minutách reperfuze se amplituda QRS v modelové skupině snížila na přibližně {{30}},8 mV, hodnota v léčebné skupině byla přibližně 0,6, 0,5, 0,5 mV pro resveratrol, skupina s nízkou dávkou 13 a skupina s vysokou dávkou 13, v tomto pořadí. Celkově léčba resveratrolem, nízkou dávkou 13 a vysokou dávkou 13 redukovala patologické zvýšení amplitudy QRS ve srovnání s modelovou skupinou během ischemie i časného reperfuzního procesu, což lze přičíst jejich ochranné aktivitě myokardu.

Spolu s monitorováním EKG byly pozorně detekovány změny srdeční frekvence. Jak je uvedeno v tabulce S3, 30 minut podvázání dramaticky snížilo srdeční frekvenci ve všech skupinách, přičemž nebyly zjištěny žádné významné rozdíly mezi žádnou z léčených skupin a modelových skupin. Po 2 hodinách reperfuze se srdeční frekvence zvýšila, ale u žádné ze skupin nebyly nalezeny žádné významné změny.

2.5.3. Účinky sloučeniny 13 na oblast infarktu a histopatologické změny

Pro hodnocení úrovně poškození myokardu byly srdeční tkáně obarveny pomocí TTC (2,35-trifenyltetrazoliumchlorid) a byly detekovány histopatologické změny. Jak je znázorněno na obrázku 10, ve skupině se simulací nebyly pozorovány žádné změny v myokardu po barvení TTC, zatímco ve skupině I/R byla pozorována škála přibližně 30 procent bílých infarktových oblastí. Ve skupině s resveratrolem a ve skupinách s nízkou dávkou 13 byly infarktové oblasti významně zmenšeny na přibližně 10 procent a oblast infarktu ve skupinách s vysokou dávkou 13 byla minimalizována na přibližně 5 procent. Obrázek 10 ukazuje výsledek vyšetření barvením HE (hematoxylin-eosin): v tkáňových řezech z modelové skupiny bylo pozorováno zvětšení srdečních buněk, částečně rozpuštěných membrán a jader a infiltrace zánětlivých buněk. Předběžné ošetření sloučeninou 13 však tyto histopatologické změny významně zmírnilo. Výsledky TTC barvení a HE barvení ukázaly, že sloučenina 13 může snížit I/R-indukovaný infarkt myokardu způsobem závislým na dávce.

3. Diskuse

Naše laboratoř zaměřená na potenciální antioxidační aktivitu anastatinů A a B syntetizovala 24 derivátů anastatinů a provedla předběžnou analýzu cytotoxicity sloučenin vůči PC-12 a jejich cytoprotektivních aktivit při oxidativním poškození vyvolaném HO [13] . V této studii jsme provedli především hloubkové biologické hodnocení 13 z 24 derivátů s nejsilnější antioxidační aktivitou.

V této studii bylo zjištěno poškození myokardu I/R v buňkách H9c2 prostřednictvím indukce léčbou H/R. Výsledky studie ukázaly, že anastatiny A a B a jejich studované deriváty zlepšily životaschopnost buněk H9c2 po léčbě H/R. Bylo zjištěno, že sloučenina 13 je nejúčinnější z 26 studovaných sloučenin, a proto byla vybrána pro další hodnocení. Aktivity LDH (marker buněčného poškození), SOD a GSH (markery oxidačního stresu) byly detekovány v supernatantech buněk H9c2 po ošetření H/R. Zjistili jsme, že předběžné ošetření testovanými sloučeninami významně snížilo hladiny LDH a zvýšilo hladiny SOD a GSH v buňkách. Předpokládali jsme tedy, že deriváty anastatinu mají kardioprotektivní aktivitu, kterou lze přičíst jejich schopnosti potlačovat oxidační stres. K hodnocení schopnosti sloučeniny pohlcovat radikály se používají testy DPPH a ABTS [14]. V důsledku toho měla sloučenina 13 vysokou antioxidační sílu a vychytávala ABTS a DPPH při nízkých hodnotách EC50, což dále ukazuje na potlačení oxidačního stresu. Ligace LAD je běžná metoda používaná k vytvoření I/R modelů myokardu. Vyhodnocením amplitudy QRS komplexu před ischemií, po ischémii a po reperfuzi jsme zjistili, že předléčení sloučeninou 13 může významně zmírnit ventrikulární arytmii během ischemie a časné reperfuze. Dále sloučenina 13 ovlivnila oblasti infarktu a také histopatologické změny infarktu myokardu. Tyto výsledky spolu se zjištěními, že sloučenina 13 potlačovala oxidační stres a zvyšovala hladiny antioxidačních enzymů v krysím séru způsobem závislým na dávce, ukázaly, že sloučenina 13 měla silný účinek proti poškození myokardu.

Závěrem lze říci, že deriváty anastatinu měly silné antioxidační schopnosti, přičemž sloučenina 13 vykazovala nejvyšší antioxidační aktivitu mezi testovanými sloučeninami. Mechanismy odpovědné za účinek derivátů anastatinů na signální dráhy související s oxidačním stresem je třeba ještě prodiskutovat. Astaxanthin (podtyp karotenoidů) může vychytávat ROS a dále zmírňovat ischemické/reperfuzní poškození [15]. Léky s potenciálem zabránit vzniku ROS by mohly být slibné u onemocnění souvisejících s oxidativním stresem [4], jako je buněčná terapie a kardiovaskulární onemocnění. Kromě toho ROS potlačuje hypoxickou indukci exprese cílového genu faktoru indukovaného hypoxií-1 (HF-1), o kterém se uvádí, že má kardioprotektivní účinek na ischemicko-reperfuzní poškození [16]. Předpokládáme, že regulační protein ROS a HIF{10}} může hrát klíčovou roli v kardioprotektivním účinku sloučeniny 13. Kyselina tournefolová B (TAB), která pochází z čínské bylinné medicíny, chrání před poškozením I/R myokardu [17 ]. Studie odhalila důležitou roli TAB při stresu endoplazmatického retikula (ER), apoptóze a drahách PI3K (fosfatidylinositol 3 kináza)/AKT (protein kináza B) při léčbě I/R poškození myokardu. Na I/R poškození myokardu se mohou podílet i další dráhy, jako je mitogenem aktivovaná proteinkináza (MAPK) [18] a AMPK (adenosin 5'-monofosfátem aktivovaná protein kináza) signální dráha [19]. Dalším krokem je proto začít s regulačními proteiny ROS a HIF{21}} a pomocí cest zprostředkovaných TAB prozkoumat mechanismy, kterými 13 uplatňuje antioxidační účinek a chrání I/R myokardu. Kromě toho by experimenty na buněčné úrovni v této studii měly být také prováděny na lidských buněčných liniích.

4. Materiály a metody

4.1. Buněčná kultura

Krysí buněčná linie kardiomyocytů H9c2 byla zakoupena od Nanjing Kebai Biotechnology Company (Nanjing, Čína). Buňky byly kultivovány v DMEM/High glukózy (Hyclone, USA) a doplněny 10 procenty FBS (Lanzhou Minhai Biological Engineering co.LTD, Lanzhou, Čína) a 1 procentem penicilinu/streptomycinu (Hyclone, Marlborough, MA, USA) ve zvlhčené inkubátor při 37 stupních s 5 procenty CO2.

4.2. Test buněčné životaschopnosti

Životaschopnost buněk byla měřena pomocí MTT testu. Buňky H9c2 byly nasazeny na 96-jamkovou destičku v množství 1 x 10* buněk/jamku po dobu 24 hodin. Poté byly buňky ošetřeny Anastatiny A a B a jejich deriváty po dobu 48 hodin nebo byly předem ošetřeny Anastatiny A a B a jejich deriváty a následně ošetřeny H/R. Poté byl přidán MTT (20 μl/jamka) a kultivován při 37 stupních po dobu 4 hodin. Absorbance byla měřena při 578 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Tecan, Infinite 50). Životaschopnost buněk ve slepé skupině byla považována za 100 procent .

4.3. Model hypoxie/reoxygenace (H/R) a podávání léků

4.3.1.H/R model

K napodobení hypoxického stavu byl použit NazS, O4, který reaguje s [20] kyslíkem a snižuje napětí kyslíku. Pro stanovení optimálních koncentrací Na2S, O4 bylo použito různých sedmi koncentrací 0,5, 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6 mM. Pro výběr optimální doby hypoxie byly kultivace 0,5, 1, 2, 3 nebo 4 h provedeny po ošetření roztokem Na2S2O4. Kultivace v normálním médiu DMEM/vysoký obsah glukózy po dobu 0, 1, 2, 3 nebo 4 hodin byla provedena, aby se napodobila doba reoxygenace [21].

4.3.2. Správa léčiv

Pro podávání léků byly anastatiny A a B a jejich deriváty (chemické struktury v tabulce S1) rozděleny do dvou skupin: anastatiny A a jejich deriváty a anastatiny B a jejich deriváty. Jako pozitivní kontrola byl použit resveratrol, o kterém se uvádí, že má kardioprotektivní účinek díky své antioxidační aktivitě. Ke stanovení koncentrace pozitivní kontroly byly hodnoceny resveratrol a další antioxidační sloučenina, kyselina gallová （3-100 μM）, pomocí testu MTT, ve kterém byly buňky ošetřeny po dobu 48 hodin 【22】. Obecně byly buňky H9c2 předem ošetřeny anastatiny A a B a jejich deriváty (10 uM konečné koncentrace) a také 10 uM resveratrolu po dobu 30 minut před ošetřením H/R.

4.4. Hodnocení antioxidační kapacity

4.4.1. Ferric Reduceing Antioxidant Power (FRAP) test

Test FRAP byl proveden podle Oivuanovy metody 【23】. Celkem bylo napipetováno 25 μl jednoprocentního ferrikyanidu draselného K3Fe（CN）6 a 10 μl sloučeniny 13, vitaminu c (kyselina askorbová, Vc) a resveratrolu (0.{{8} } mM) plus 1 x PBS (pH =6 0,6). Směs byla udržována v 50stupňové vodní lázni po dobu 20 minut s následným rychlým ochlazením ledem. Poté bylo postupně přidáno 25 μl 10% kyseliny trichloroctové (TCA), 0,1% chloridu železitého (FeCl) a destilovaná voda. Směs byla přenesena do 96-jamkové destičky a absorbance byla analyzována při 650 nm. K sestavení standardní křivky byl použit roztok Vc (20-200 ug/ml). Antioxidační schopnosti byly vypočteny z lineární kalibrační křivky a reprezentovány jako ekvivalenty Vc.

4.4.2.Metoda ABTS

Aktivita vychytávání radikálů ABTS [24] byla provedena podle Sugahara et al. a Re a kol. Roztoky ABTS byly zředěny tak, aby se absorbance spektrofotometricky upravila na 650 z 0,70±0.02 nm a aktivity ABTSscavenging byly měřeny podle následující vzorec, E=((Akontrola-Ablank)-(A2 -A1)/(A kontrola-Ablank))×10, kde kontrola je absorbance kontrolní reakce obsahující 130 μl ABTS · plus pracovní roztok a 5,5 μl ředidla vzorků （DMSO） a Ablank je absorbance 130 μl pufru octanu sodného a 5,5 μl DMSO. A je absorbance 130 μl ABTS plus pracovního roztoku (pufr octanu sodného) a 5,5 μl sloučeniny 13（0.02-20 mM） a Az je absorbance 130 μl pufru octanu sodného a 5,5 μl sloučeniny 13（ 0.{30} mM）. Všechny směsi byly vortexovány po dobu 30 s a inkubovány při teplotě místnosti po dobu 10 minut s následným měřením absorbance při 650 nm. ECso byla vypočtena pomocí lineárního vztahu mezi koncentrací sloučeniny a pravděpodobností procenta inhibice ABTS.

4.5. Ischemicko-reperfuzní model

4.5.1. Péče o zvířata

Krysy Sprague Dawley (SD) byly získány z Laboratorního zvířecího centra Vojenské akademie lékařských věd PLA (Peking, Čína). Padesát samců potkanů ​​SD o hmotnosti od {{0}}} g bylo aklimatizováno po dobu jednoho týdne při pokojové teplotě 23±1 stupeň s 12hodinovým cyklem světlo/tma a byla jim poskytnuta potrava a voda. Potkani byli rozděleni do pěti skupin: slepá skupina (krysy nedostávaly žádnou léčbu, ale simulovanou operaci), modelová skupina (krysy dostávaly léčbu vehikulem a MI/R operaci), skupina resveratrolu (krysy dostávaly 200 mg/kg resveratrolu a MI/R operace), skupina s nízkou dávkou 13 (krysy dostávaly 100 mg/kg sloučeniny 13 a operace MI/R) a skupina 13 s vysokou dávkou (krysy dostávaly 200 mg/kg sloučeniny 13 a operace MI/R). Sloučeniny byly formulovány v 0,5% sodné soli karboxymethylcelulózy a dávkovány jako suspenze v množství 1 ml/kg orálně jednou denně po dobu sedmi dnů. Všechny pokusy na zvířatech byly provedeny v souladu s příručkou National Institutes of Health pro péči a použití laboratorních zvířat a schváleny Akademickým výborem Tianjin University of Science and Technology.

4.5.2. Experimentální protokol

Krysy Sprague Dawley byly anestetizovány 20procentním uretanem (0,8 ml/100 g) a poté jsme provedli ischemii myokardu levou přední sestupnou (LAD) ligací. Srdce bylo exponováno přes levou hrudní incizi a umístěno na 4-0 hedvábný steh, aby se provedla regionální ischemie po dobu 30 minut ischemie, po které následovaly 2 hodiny reperfuze. Důkaz ischemie myokardu byl potvrzen elevací ST segmentu a zvýšením amplitudy QRS. Během experimentu byly krysy udržovány na ventilátoru DW3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Peking, Čína). Srdeční frekvence a EKG byly monitorovány pomocí systému získávání biologického signálu MD3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Peking, Čína). Po monitorování ischemického/reperfuzního procesu byly krysy usmrceny a vzorky krve a srdeční homogenáty byly použity k detekci poškození myokardu za použití detektivních komerčních souprav.

4.5.3. Barvení TTC a barvení HE

Rozsah ischemické oblasti byl kvantifikován barvením trifenyltetrazoliumchloridem (TTC). Vzorky srdce byly okamžitě zmraženy na {{0}} stupeň po dobu 10 minut a bylo vyrobeno pět plátků tenkých 1 až 2 mm plátků. Poté byly řezy umístěny do 1% TTCfosfátového pufru (pH=7.0) a barveny při 37 stupních po dobu 20 minut a byly fixovány ve formalínu. Snímky byly získány pomocí digitální kamery a procento infarktové oblasti (TTC-negativní) a rizikové oblasti (TTC-pozitivní) bylo měřeno pomocí softwaru ImageJ [25]. Pro barvení HE byla oblast postižená infarktem vyříznuta a fixována v 10% formaldehydu a poté uložena do parafínu. Poté byly tkáně obarveny HE (hematoxylin-eozin) a zkoumány pod světelným mikroskopem. Dehydrované zapuštěné sekce a těsnicí sekce byly uvedeny do provozu společností Tianjin YiSheng Yuan Biotechnology Company (Tianjin, Čína).

4.6. Komerční spektrofotometrické soupravy

Komerční soupravy použité v tomto výzkumu byly zakoupeny od Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd. (Peking, Čína) a Nanjing Jiancheng Bioengineering Company (Nanjing, Čína). byly hodnoceny aktivity kreatinkinázy (CK), glutathionu (GSH) a superoxiddismutázy (SOD). Aktivity malondialdehydu (MDA) byly měřeny pomocí homogenátu krysího srdce. Všechny komerční soupravy byly provedeny podle pokynů výrobce.

4.7. Proces statistiky

Všechny experimenty byly opakovány alespoň třikrát. Experimentální data byla zpracována pomocí softwaru GraphPad Prism7 a experimentální výsledek každé skupiny byl vyjádřen jako průměr ± standardní odchylka (x± s). K porovnání statistické významnosti mezi skupinami byl použit t-test. P<0.05 was="" recorded="" as="" statistically="">

Reference

1. Uzdensky, AB; Demyanenko, S. Acetylace histonů a deacetylace u ischemické mrtvice. Neural Regen. Res. 2021, 16, 1529–1530. [CrossRef] [PubMed]

2. Li, H.; Yin, A.; Cheng, Z.; Feng, M.; Zhang, H.; Xu, J.; Wang, F.; Qian, L. Útlum amplifikační signální dráhy Na/K-ATPázy/Src/ROS pomocí pNaktide zlepšuje ischemicko-reperfuzní poškození myokardu. Int. J. Biol. Macromol. 2018, 118, 1142–1148. [CrossRef] [PubMed]

3. Levin, RM; Xia, L.; Wei, W.; Schuler, C.; Leggett, RE; Lin, ADY Účinky sporu rozbité skořápky Ganoderma Lucidum na oxidační stres králičího močového měchýře za použití in vivo modelu ischemie/reperfuze. Mol. Buňka. Biochem. 2017, 435, 25–35. [CrossRef] [PubMed]

4. Tan, Z.; Liu, H.; Píseň, X.; Ling, Y.; On je.; Yan, Y.; Yan, J.; Wang, S.; Wang, X.; Chen, A. Honokiol po léčbě zlepšuje ischemické/reperfuzní poškození myokardu zvýšením autofagického efluxu a snížením intracelulární produkce ROS. Chem. Biol. Komunikujte. 2019, 307, 82–90. [CrossRef] [PubMed]

5. Hausenloy, DJ; Yellon, DM Ischemicko-reperfuzní poškození myokardu: opomíjený terapeutický cíl. J. Clin. Vyšetřování. 2013, 123, 92–100. [CrossRef]

6. Yu, C.; Li, D.; Li, Z.; Yu, D.; Zhai, G. Vliv sakubitrilu/valsartanu na zánět a oxidační stres v modelu srdečního selhání vyvolaného doxorubicinem u králíků. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 473–484. [CrossRef]

7. Wang, Y.; Che, J.; Zhao, H.; Tang, J.; Shi, G. Platycodin D inhibuje oxidační stres a apoptózu v H9c2 kardiomyocytech po hypoxii/reoxygenačním poškození. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2018, 503, 3219–3224. [CrossRef]

8. Pavlovič, M.; BNáfrádi Rouster, P. Vysoce stabilní enzym napodobující nanokompozit s antioxidační aktivitou. J. Colloid Interface Sci. 2019, 543, 174–182. [CrossRef]

9. Qi, HZ; Wangi, WZ; On, JY Antioxidační systém Deinococcus radiodurans. Res. Microbiol. 2019, 171, 822–831. [CrossRef]

10. Shao, L.; Shao, Y.; Yuan, Y. Pinocembrin flavanon inhibuje životaschopnost buněk u PC-3 lidské rakoviny prostaty tím, že indukuje buněčnou apoptózu, produkci ROS a zastavení buněčného cyklu. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 669–678. [CrossRef]