Umlčení MiR-103a-3p zlepšuje usazování šťavelanu vápenatého v ledvinách potkana aktivací osy UMOD/TRPV5

2.10. Bioinformatická analýza a luciferázový test.

UMOD-cílená miRNA, miR-103a-3p, byla předvídatelně analyzována společnostíWebová stránka TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)a poté byla validována pomocí luciferázového testu. ovládací prvek pGL3-vektory (E1741) byly zakoupeny od Promega (USA).zkonstruujte divoký typ UMOD (UMOD-WT, 5′-AGCCUGUGUCUUUAAAUGCUGCU-3′) a mutantní typz UMOD (UMOD-MUT, 5′-AGCCUGUGUCUUUAAAUGAUCCU-3′). NRK-52E buňky byly kotransfekovány smiR-103a-3p mimika a UMOD-WT nebo miR-103a-3pmimiku a UMOD-MUT s pomocí Lipofectamine2000. Identický postup byl proveden u mimikakontrola (pRL-TK vektory, VT1568, YouBio, Čína). Pože jsme určili luciferázovou aktivitu v buňkách pomocíDual-Luciferase Reporter Assay Kit (E1910, Promega, USA).2.11. Zavedení modelu hyperoxalurie in vivo.Proin vivoVe studii jsme vytvořili model hyperoxalurie u potkanůpřidáním 1% ethylenglykolu (EG) (324558, Sigma-Aldrich,USA) na pitnou vodu. Pokus na zvířatech bylschválený Výborem pro laboratorní zvířata TheTřetí Affinemocnice lékařské univerzity Xinxiang(IHRM20200510). Celkem 40 mužů Sprague Dawley (SD)krysy (8 týdnů staré, 180–210 g) zakoupené od Charles RiverLaboratoře (Peking, Čína) byly použity vin vivostudie. Všekrysy byly rozděleny do 4 skupin kontroly, EG, EG + antagomir a EG + antagomir-NC, s deseti potkany v každé skupině.Během ustájení byly v kontrolní skupině pouze krysys vodou z vodovodu; ve skupině EG byly ošetřeny krysys 1 % EG; ve skupině EG + antagomir byly krysyléčeno 1% EG a intravenózně injikováno miR-103a-3p antagomir; a ve skupině EG + antagomir-NC,krysy byly ošetřeny 1% EG a intravenózně injikoványs miR-103a-3p antagomir-NC. Po 4 týdnech všechny krysybyli sakrificed cervikální dislokací v anestezii(pentobarbital sodný, 40 mg/kg, P-010, Merck, USA) aledvinové tkáně byly odebrány pro histologickou studii. ThemiR-103a-3p antagomiry použité v tomto experimentu bylyzískané z Ribobio (Guangzhou, Čína).

NOVÁ BYLINNÁ FORMULE PROLEDVINOVÉ TKÁNĚ

2.12. Barvení hematoxylin-eosinem (HE).

Formalinem fixované ledvinové tkáně byly zality v parafínu pro hodnocení ukládání CaOx. Nařezané vzorky byly před barvením HE zbaveny vosku a hydratovány. Poté byla k ošetření vzorků použita souprava HE Stained Kit (C0105S, Beyotime, Čína) podle provozních pokynů. Po utěsnění tkání byla oblast depozice krystalů pozorována pod polarizačním mikroskopem (Axio Scope.A1, Precise Instrument, Čína) při zvětšení 100 a byla kvantifikována pomocí ImageJ (vize 1.8.0, National Institutes of Health, USA).

Obrázek 5: Pokračování.

Obrázek 5: Umlčení miR-103a-3p aktivovalo osu UMOD/TRPV5, aby zeslabilo buňky NRK-52E z poškození způsobeného oxalátem. (a) Byl stanoven účinek inhibitoru miR-103a-3p na životaschopnost buněk v buňkách NRK-52E ošetřených oxalátem, TRPV5-nadměrně exprimujícím plazmidem a siUMOD pomocí MTT testu. (b) Test adheze krystalických buněk byl použit ke kvantifikaci ukládání CaOx ve specifikovaných buňkách (zvětšení 200, měřítko=200 μm). (c) Souprava Fluo{12}} AM analyzovala měření obsahu Ca{13}} v různých skupinách. ∗∗∗p < 0:001 vs. oxalát; ###p < 0:001 vs. oxalát + TRPV5 + siNC + IC; ∧∧p < 0:01 a ∧∧∧p < 0:001 vs. oxalát + TRPV5 + siUMOD + IC. TRPV5: podrodina V člen 5 kationtového kanálu s přechodným potenciálem receptoru; UMOD: uromodulin; MTT: methyl thiazolyl difenyl-tetrazolium bromid; NC: negativní kontrola; siUMOD: malá interferující RNA proti UMOD; I: inhibitor; IC: kontrola inhibitorem.

2.13. Imunohistochemie (IHC).

Ke studiu distribuce TRPV5 v renálních tkáních jsme použili soupravu Super Plus™ High Sensitive and Rapid Immunohistochemical Kit (E-IR R221, Elabscience, Čína) k provedení IHC. Stručně řečeno, řezy ledvin (4 μm) byly ošetřeny Dewaxing/Antigen Retrieval Buffer po dobu 30 minut při zahřívání a následně inkubovány s SP Reagent B Peroxidase Blocking Buffer při pokojové teplotě po dobu 15 minut. Po promytí PBS byly řezy zreagovány s protilátkou anti-TRPV5 (ab137028, 1/100, Abcam, UK) při 37 °C po dobu 2 hodin, poté následovala inkubace sekundární protilátky. Poté byly řezy požadovány pro vývoj barvy v pracovním roztoku DAB a barvení v hematoxylinovém pufru. Po ošetření přemodráním byly barvené obrazy zachyceny pomocí mikroskopu (CX23, Olympus, Japonsko) při zvětšení 100x.

2.14. Statistická analýza.

Všechny experimenty byly opakovány třikrát jednotlivě, přičemž naměřená data byla popsána jako průměr ± standardní odchylka. Rozdíly ve srovnání mezi více skupinami byly analyzovány jednosměrnou analýzou rozptylu. Pro analýzu dat byl použit GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, USA) a p-hodnota < 0,05 indikovala statisticky významný rozdíl.

NOVÁ BYLINNÁ FORMULE PROLEDVINOVÉ TKÁNĚ

3. Výsledky

3.1. Upregulace TRPV5

Chráněné buňky NRK-52E zZranění způsobené oxaláty. Na základě klíčové role TRPV5 při regulaci transportu Ca2+ vrenální tubulární buňkyjsme nejprve provedli nadměrnou expresi TRPV5 v buňkách NRK-52E. Jak je ukázáno na obrázku 1(a), pomocí qRT-PCR bylo detekováno významné zvýšení hladiny mRNA TRPV5 (p < 0:001). Western blot také změřil vysokou hladinu proteinu TRPV5 v transfekovaných buňkách (obrázek 1(b), p < 0:001). Po ošetření oxalátem v buňkách NRK-52E jsme zjistili, že exprese TRPV5 byla downregulována ve srovnání s expresí kontrolní skupiny, což bylo zvráceno transfekcí plazmidu nadměrně exprimujícího TRPV{13}} (obrázek 1(c), p < 0:001). Navíc detekce Western blotu vykazovala podobné výsledky (obrázek 1(d), p < 0:001). Následující test MTT ukázal, že oxalát se účastní a životaschopnost buněk, která byla poté částečně převrácenaNadměrná exprese TRPV5(Obrázek 1(e), p < 0:05). Prokázala to detekce krystalové adhezeNadměrná exprese TRPV5nápadně inhiboval adhezi CaOx indukovanou oxalátem v buňkách NRK-52E (obrázek 1(f)).

.

Obrázek 6: Umlčení miR-103a{2}}p zmírnilo depozici CaOx indukovanou EG v tkáních ledvin in vivo aktivací osy UMOD/TRPV5. (a, b) Depozice CaOx byla měřena barvením H&E v ledvinových tkáních potkanů ​​léčených EG nebo EG a miR-103a-3p antagomirem (×100 zvětšení, měřítko=200 μm). (c) Western blot byl použit k měření hladin proteinu UMOD a TRPV5 v ledvinových tkáních potkanů ​​léčených EG nebo EG a miR{{10}}}a-3p antagomir. -Aktin sloužil jako vnitřní kontrola. (d) IHC analýza exprese TRPV5 byla provedena v tkáních různých skupin (zvětšení x 100, měřítko=200 μm). ∗∗∗p < 0:001 vs. kontrola; #p < 0:05, ###p < 0:001 vs. EG + antagomir-NC. HE: hematoxylin a eosin EG, ethylenglykol; TRPV5: podrodina V člen 5 kationtového kanálu s přechodným potenciálem receptoru; UMOD: uromodulin; NC: negativní kontrola; IHC: imunohistochemie

3.2. Indukce oxalátem

Downregulovaná exprese UMOD, která byla pozitivně spojena s obohacením TRPV5 na buněčném povrchu. Bylo zjištěno, že exprese mRNA UMOD je v buňkách NRK-52E indukovaných oxalátem snížena (obrázek 2(a), p < 0:001), tak jako jeho hladina bílkovin (obrázek 2(b), p < 0:01). Výsledky CoIP potvrdily, že UMOD byl značně koimunoprecipitován anti-flag-značeným TRPV5, a naopak, TRPV5 byl koimunoprecipitován anti-UMOD (obrázek 2(c)). Dále jsme upregulovali expresi UMOD v buňkách NRK-52E, což bylo ověřeno pomocí qRT-PCR a Western blotu. Pozoruhodné zvýšení exprese UMOD stanovené v mRNA (obrázek 2(d), p < 0:001) a hladin proteinů (obrázek 2(e), p < 0:001) znamenalo úspěšnou transfekci. Kromě toho výsledky testu biotinylace na buněčném povrchu odhalily, že TRPV5 byl v hojném množství na povrchu buněk NRK- 52E kotransfekovaných nadměrnou expresí UMOD a TRPV5 ve srovnání s jeho negativní kontrolou (obrázek 3(a)).

3.3. UMOD

Reguloval ochrannou roli TRPV5 v buňkách indukovaných oxalátem. (Obrázek 3(a)). Abychom odhalili souhru UMOD a TRPV5 v buňkách NRK-52E indukovaných oxalátem, provedli jsme transfekci siUMOD. QRT PCR určila, že UMOD mRNA je exprimována na nízké úrovni v buňkách transfekovaných siUMOD (obrázek 3(b), p < 0:001) a podobný výsledek v jeho hladina proteinu byla měřena Western blotem (obrázek 3(c), p < 0:001). Následně testy MTT a krystalové adheze prokázaly, že siUMOD výrazně kompenzuje podpůrný účinek TRPV5 na životaschopnost buněk (obrázek 3 (d), p < 0:01) a inhibiční účinek TRPV5 na adhezi CaOx (obrázek 3 (e)) v NRK-52E buňkách indukovaných oxalátem. Kromě toho jsme měřili obsah Ca2+ po divergentních transfekcích. Jak je popsáno na obrázku 3(f), TRPV5 výrazně omezil oxalátem indukovanou redukci intracelulární koncentrace Ca2+ buněk NRK-52E buněk, která byla částečně obnovena přidáním Simona (p < 0: 001).

3.4. miR-103a-3p

Cílená UMOD a je zprostředkována v regulaci osy UMOD/TRPV5 v buňkách indukovaných oxalátem. S pomocí webu TargetScan výsledek genové predikce ukázal, že miR-103a-3p může obsahovat vazebná místa pro UMOD (obrázek 4(a)). Poté luciferázový test detekoval potlačenou aktivitu luciferázy v buňkách kotransfekovaných miR-103a-3p mimikem a UMOD WT (obrázek 4(b), p < 0:{{21 }}01). Abychom pochopili regulační účinek miR{{10}}}a{11}}p na UMOD, implementovali jsme inhibici miR- 103a{13}}p v NRK{{14} }E buňky s detekcí qRT-PCR potvrzující, že exprese miR-103a-3p byla silně snížena po transfekci inhibitoru miR- 103a-3p ( Obrázek 4(c), p < 0:001). Zajímavé je, že exprese mRNA UMOD byla prokázána jako zvýšená po inhibici miR-103a-3p, která byla viditelně převrácena přidáním umlčení UMOD (obrázek 4(d), p < 0:01 ). Detekcí Western blotu bylo zjištěno, že změna exprese proteinu UMOD je stejná jako u exprese mRNA UMOD (obrázek 4(e), p < 0:01). Kromě toho jsme provedli záchranné experimenty týkající se buněčných funkcí. Jak bylo ukázáno, regulační úloha osy UMOD/TRPV5 v životaschopnosti buněk (obrázek 5(a), p < 0:001), adhezi CaOx (obrázek 5(b)) a intracelulární koncentraci Ca2+ (obrázek 5(c), p < 0:01) byl překvapivě zvrácen inhibitorem miR- 103a-3p.

3.5. miR-103a-3p

Umlčení zmírněné EG-indukované depozice CaOx v ledvinových tkáních in vivo aktivací osy UMOD/TRPV5. Abychom dále podpořili naše zjištění in vitro, zkonstruovali jsme krysí model hyperoxalurie pro studii in vivo. Jak je znázorněno na obrázcích 6(a) a 6(b), podstatná depozice krystalů CaOx v tkáních ledvin EG skupiny byla pozorována ve srovnání s kontrolní skupinou a tento trend byl zvrácen pomocí miR-103}a{{ 5}}p Santiagomir (p < 0:001). Výsledky Western blotu pak ukázaly, že EG silně downreguloval hladiny proteinu UMOD i TRPV5, což bylo výrazně obnoveno miR-103a- 3p antagomirem (obrázek 6(c), p < 0:05 ). Pomocí IHC jsme zaznamenali, že exprese TRPV5 byla downregulována ve skupině EG ve srovnání s kontrolní skupinou a byla upregulována ve skupině EG + antagomir ve srovnání se skupinou EG + antagomir-NC (obrázek 6(d)).

4. Diskuse

V kontextu stále rozmanitější chirurgické léčby ledvinových kamenů je třeba zdůraznit, že významné metody prevence jejich výskytu a recidivy [27]. Nejčastější složkou ledvinových kamenů jsou krystaly CaOx. Vznik ledvinových kamenů obsahujících Ca2+- ovlivňuje mnoho faktorů, přičemž zdaleka hlavním uznávaným rizikovým faktorem je hyperkalkuliura [28]. Tsuruoka a kol. prokázali, že snížená reabsorpce Ca2+ prostřednictvím renálních tubulů je zásadní pro indukci hyperkalciurie a že aktivní reabsorpce vápníku může být regulována různými faktory [29]. Později Worcester a kol. navrhli, že postprandiální hladiny Ca2+ v moči byly výrazně vyšší u pacientů s hyperkalciurií ve srovnání s kontrolami, i když sekrece parathormonu v krvi a renální zátěž byly na stejné úrovni [30]. Souhrnně je třeba poznamenat, že porucha renální tubulární reabsorpce může být hlavním důvodem hyperkalciurie. Tato studie proto prozkoumala základní molekulární mechanismus, který reguluje hladiny Ca2+ v moči z hlediska zpětného vstřebávání Ca2+, aby se vytvořily významné kanály pro prevenci a léčbu ledvinových kamenů.

TRPV5 působí jako renální tubulární epiteliální Ca2+ kanál, který zprostředkovává transport a reabsorpci Ca2+ v ledvinách [31]. Jang a kol. poukázal na to, že exprese proteinu TRPV5 byla zjevně downregulována v renálních tkáních hyperkalcémie močových potkanů, ale byla obnovena podáváním hydrochlorothiazidu, což naznačuje, že mechanismu léčby hyperkalciurie hydrochlorothiazidem lze dosáhnout prostřednictvím upregulace exprese proteinu TRPV5 v renálních tkáních [32]. Studie potvrdily, že vysoká oxalurie indukuje produkci reaktivních forem kyslíku (ROS), poškozuje renální tubulární epiteliální buňky a mění strukturu fosfatidylserinu v buněčné membráně, což vede k adhezi CaOx k povrchu renálních tubulárních epiteliálních buněk [33]. V předchozím výzkumu jsme odhalili, že pozoruhodně downregulovaný TRPV5 se objevil po indukci poškození NRK-52E buněk oxalátem, jehož trend byl obrácen po transfekci nadměrné exprese TRPV5. Upregulace TRPV5 navíc zvýšila životaschopnost buněk a inhibovala adhezi CaOx v buňkách NRK-52E indukovaných oxalatem, což naznačuje, že TRPV5 vytváří kritický preventivní účinek na tvorbu CaOx kamenů v ledvinách vyvolanou oxaláty.

CISTANCHE PRO ZLEPŠENÍ šťavelan vápenatý

Jako primární kanál pro reabsorpci Ca2+ mohla být aktivita a exprese TRPV5 regulována mnoha faktory [34]. Nedávná studie například potvrdila, že UMOD zabraňuje tvorbě ledvinových kamenů stimulací reabsorpce Ca2+ prostřednictvím TRPV5 [35]. Kromě toho bylo zaznamenáno, že 87,5 % myší s knockoutem UMOD vytvořilo ve věku 15 měsíců kameny z oxalátu vápenatého a fosforečnanu vápenatého v CNT, ledvinové dřeni a papilách. Všechna tato zjištění naznačují, že UMOD by mohl interagovat s TRPV5 při tvorbě ledvinových kamenů, což dosud nebylo potvrzeno. Naše studie však poprvé identifikovala existenci interakce, která UMOD pozitivně regulovala fungování exprese TRPV5 v poškozených buňkách NRK-52E posílením buněčné životaschopnosti, snížením adheze CaOx a zvýšením reabsorpce Ca{{12} }.

miRNA se podílejí na rozvoji a progresi onemocnění ledvin prostřednictvím jejich cílené regulace mRNA. Bylo zjištěno, že miR-21 přispívá k poškození renálních tubulárních buněk indukovaném oxaláty prostřednictvím upregulace PPARA [36]. Kromě toho Jiang a kol. uvedli, že inhibice miR-155-5p k upregulaci exprese MGP by mohla pozorovatelně zmírnit oxalátem indukované poškození oxidativním stresem v ledvinách [37]. Nicméně jen málo studií bylo věnováno zjištění mechanismu regulace miRNA na UMOD ovlivňující tvorbu ledvinových kamenů. K získání dalšího vhledu do patogeneze tohoto onemocnění použila tato studie bioinformatickou analýzu a luciferázový test k nalezení miRNA, miR-103a-3p, potenciálně regulující UMOD. Při výzkumu onemocnění ledvin bylo potvrzeno, že cyklus miR-103a-3p má hluboký dopad na zánět ledvin a fibrózu [38]. Peters a kol. také naznačil, že miR-103a-3p by mohl být považován za potenciální biomarker u chronického onemocnění ledvin [39]. V naší studii jsme ověřili molekulární mechanismus miR-103a-3p v ledvinových kamenech, že umlčení miR- 103a-3p by mohlo zmírnit poškození způsobené oxaláty NRK-52E buňky aktivací osy UMOD/TRPV5. Kromě toho jsme tento regulační mechanismus prokázali ještě silněji prostřednictvím in vivo experimentů na EG-indukovaných potkaních modelech. V této studii však není dostatek pozornosti, protože zahrnuje jeden typ buňky a relativně malý počet proměnných studie v experimentech in vitro.

CISTANCHE PRO ZLEPŠENÍ šťavelan vápenatý

5. Závěry

Celkově naše současná studie odhalila, že umlčení miR-103a-3p zlepšuje ukládání CaOx v ledvinách potkana aktivací osy UMOD/TRPV5, která pokládá nový teoretický základ pro strategie prevence, diagnostiky a léčby směrem k ledvinovým kamenům z pohledu reabsorpce Ca2+.

Dostupnost dat Analyzované soubory dat vytvořené během studie jsou k dispozici od odpovídajícího autora na přiměřenou žádost.

Střet zájmů Autoři prohlašují, že v souvislosti se zveřejněním tohoto příspěvku neexistuje žádný střet zájmů.

Reference

[1] RE Hautmann a M. Straub, "Urinární kameny. Metabolismus a diagnóza," Urologe A, sv. 45, č. 4, s. 181–184, 2006. [2] Z. Kirkali, R. Rasooly, RA Star a GP Rodgers, "Urinary stone disease: progress, status, and needs," Urology, sv. 86, ne. 4, s. 651–653, 2015.

[3] AL Rodgers, "Rasa, etnicita a urolitiáza: kritický přehled," Urolitiáza, sv. 41, č. 2, s. 99–103, 2013.

[4] K. Sakhaee, "Nedávné pokroky v patofyziologii nefrolitiázy," Kidney International, sv. 75, č.p. 6, s. 585–595, 2009.

[5] T. Knoll, AB Schubert, D. Fahlenkamp, ​​DB Leusmann, G. Wendt-Nordahl a G. Schubert, "Urolitiáza v průběhu věků: údaje o více než 200000 analýzách močových kamenů," The Journal of Urology, sv. 185, č.p. 4, s. 1304–1311, 2011. [6] T. Mitchell, P. Kumar, T. Reddy a kol., "Dietary oxalate and renal stone creation," American Journal of Physiology. Fyziologie ledvin, sv. 316, č.p. 3, s. F409–f413, 2019. [7] SR Khan, MS Pearle, WG Robertson a kol., "Kameny v ledvinách," Nature Reviews. Disease Primers, sv. 2, č. 1, str. 16008, 2016.

[8] CY Pak, HJ Heller, MS Pearle, CV Odvina, JR Poindexter a RD Peterson, "Prevence tvorby kamenů a úbytku kostní hmoty u absorpční hyperkalciurie kombinovanými dietními a farmakologickými intervencemi," The Journal of Urology, sv. 169, č.p. 2, s. 465–469, 2003.

[9] GC Curhan, WC Willett, EL Knight a MJ Stampfer, "Faktory stravy a riziko výskytu ledvinových kamenů u mladších žen: zdravotní studie sester II," Archives of Internal Medicine, sv. 164, č.p. 8, s. 885–891, 2004.

[10] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi a kol., "Dietní rostliny pro prevenci a léčbu ledvinových kamenů: preklinické a klinické důkazy a molekulární mechanismy," International Journal of Molecular Sciences, sv. 19, č. 3, str. 765, 2018.