Alginátový oligosacharid zmírňuje stárnutí srdce vyvolané D-galaktózou prostřednictvím regulace funkce a integrity mitochondrií myokardu u myší
Aug 25, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
Abstraktní
Stárnutí je rozhodujícím rizikovým faktorem pro rozvoj kardiovaskulárních onemocnění souvisejících s věkem. Proto je třeba hluboce studovat molekulární mechanismy stárnutí a nové intervence proti stárnutí. Alginátový oligosacharid (AOS) má vysoké farmakologické aktivity a příznivé účinky. Naše studie byla provedena s cílem zjistit, zda lze AOS použít jako lék proti stárnutí ke zmírnění stárnutí srdce a srdce. Stárnoucí myši C57BL/6J indukované D-galaktózou (D-gal) byly založeny subkutánní injekcí D-gal (200 mg-kg'-d') po dobu 8 týdnů. AOS (50,100 a 150 mg;kg'l.d') byly podávány intragastricky po dobu posledních 4 týdnů. Výsledkem bylo, že AOS zabránil srdeční dysfunkci u stárnoucích myší vyvolaných D-gal, včetně částečně zachované ejekční frakce (EF procenta) a frakčního zkrácení (FS procenta).cistanche benefíciosAOS inhibovala D-gal-indukovanou up-regulaci natriuretických peptidů A (ANP), mozkového natriuretického peptidu (BNP) a markerů stárnutí p53 a p21 způsobem závislým na dávce. Aby bylo možné dále prozkoumat potenciální mechanismy přispívající k ochrannému účinku AOS proti stárnutí, byl analyzován mitochondriální kompromis související s věkem. Naše data ukázala, že AOS zmírnil stárnutí srdce vyvolané D-gal zlepšením mitochondriální biogeneze, zachováním mitochondriální integrity a zvýšením účinného odstranění poškozených mitochondrií. AOS také snížila produkci ROS a stav oxidačního stresu, což zase dále inhibuje zničení srdečních mitochondrií. Tyto výsledky společně ukazují, že AOS může být účinným terapeutickým činidlem pro zmírnění srdečního stárnutí.
KLÍČOVÁ SLOVA
alginátový oligosacharid, srdeční stárnutí, D-galaktóza, mitochondrie, oxidační stres
1|ÚVOD
Stárnutí lze obecně definovat jako časově závislé hromadění buněčného poškození, které způsobuje progresivní funkční úpadek tkání a orgánů.¹ Obecně platí, že změny srdce související s věkem zahrnují především hypertrofii levé komory, zvýšenou fibrózu myokardu a srdeční nedostatečnost.Cistanche Extract Anti RadiationStárnutí je rozhodujícím rizikovým faktorem pro rozvoj kardiovaskulárních onemocnění souvisejících s věkem, což vede k výrazně zvýšené prevalenci kardiovaskulárních onemocnění ve stárnoucí populaci.23 Je tedy naléhavě zapotřebí účinnějších léčebných strategií pro léčbu srdeční nedostatečnosti způsobené stárnutím. .
Alginát je přírodní polysacharid získaný z mořských řas extrahovaný z hnědých řas. Alginátový oligosacharid (AOS) se vyrábí depolymerizací alginátu, který má řadu jedinečných výhod, jako je rozpustný ve vodě, netoxický, neimunogenní a biologicky odbouratelný. AOS vyvíjí slibné biologické aktivity. Tento oligosacharid má neuroprotektivní, hypolipidemické, antioxidační, „protizánětlivé“, antiagregační, protinádorové, 10 antibakteriální a imunoregulační vlastnosti a také potlačuje obezitu¹ a pokročilé glykační aktivity koncových produktů (AGE). .4 Zejména nebyly prozkoumány žádné studie schopnosti AOS chránit před stárnutím srdce.
Mitochondrie jsou dvoumembránové organely a slouží vícenásobným funkcím v buněčné bioenergetice a metabolismu.14 Srdce je orgán s vysokou energetickou náročností a vysokým obsahem mitochondrií. Srdeční mitochondrie vytvářejí 90 procent ATP a hrají zásadní roli při udržování zdravého srdce.cistanche herbaMitochondriální dysfunkce, která může urychlit proces stárnutí u savců, je jedním z nejdůležitějších mechanismů stárnutí.15;16 Věkem související dysfunkce mitochondrií vykazuje různé rysy včetně ztráty mitochondriální integrity, snížené účinnosti mitochondriální biogeneze, defektní kvality kontrola autofagií, snížený mitochondriální membránový potenciál (MMP), změny v mitochondriální dynamice, zvýšená tvorba reaktivních forem kyslíku (ROS) a akumulace mutací v mitochondriální DNA (mtDNA).17V důsledku nižší biogeneze a snížené clearance kombinace zvýšeného poškození a snížené obnovy v mitochondriích může nakonec přispět k procesu stárnutí.18,17 Kromě toho má progresivní mitochondriální dysfunkce za následek zvýšenou produkci ROS a oxidativní stres, což následně způsobuje další deterioraci mitochondrií a poškození buněk a nakonec přispívá na věkem podmíněnou srdeční dysfunkci.20
Cistanche může proti stárnutí
Zvířecí modely stárnutí vyvolané D-galaktózou (D-gal) byly široce používány ke studiu mechanismů stárnutí a účinků léků proti stárnutí.21 Chronické podávání velkého množství D-gal způsobuje poruchy buněčného metabolismu a poškození buněk, které urychlují proces stárnutí a nakonec způsobí strukturální a funkční změny v kardiovaskulárním systému.22 Proto jsme v současné studii vytvořili model stárnutí myší vyvolaný D-gal, abychom systémově vyhodnotili aktivitu AOS proti srdečnímu stárnutí a dále zkoumali možný základní mechanismus.
2|MATERIÁLY A METODY
2,1|Léky a činidla
D-galaktóza byla získána od Sigma-Aldrich. AOS byl zakoupen od Qingdao BZ Oligo Biotech Co., Ltd. Souprava pro test malondialdehydu (MDA) byla získána od Jiancheng Bioengineering Institute. Králičí polyklonální protilátky proti BNP, PGC-1a, p67-phox a gp91-phox byly získány od společnosti Abcam Inc. Králičí monoklonální protilátky proti natriuretickým peptidům A (ANP) a SIRT3 a myší monoklonální protilátky proti p53 byly získány od Abcam Inc. Králičí polyklonální protilátky proti beclin-1 a p-mTOR byly zakoupeny od společnosti Cell Signaling Technology. Králičí polyklonální protilátka proti p21 a myší monoklonální protilátka proti p47-phox byly získány od Santa Cruz Biotechnology, Inc. Králičí polyklonální protilátky proti mTOR byly zakoupeny od Proteintech Group, Inc. Mitochondriální extrakční souprava a JC{{14} } Kit pro stanovení potenciálu mitochondriální membrány byl zakoupen od společnosti Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. Kit TIANamp Genomic DNA byl získán od společnosti Tiangen Biotech (Beijing) CO., LTD.cistanche růst penisuSouprava PCR sondy myší mtDNA byla zakoupena od společnosti Beijing Tiandz Gene Technology CO., Ltd. Byly zakoupeny kozí anti-králičí IgG (H＋L) (peroxidáza/HRP konjugovaný) a kozí anti-myší IgG (H plus L) (peroxidáza/HRP konjugovaný). od Elabscience Biotechnology Co., Ltd. Všechny ostatní chemikálie a činidla byly zakoupeny od standardních komerčních dodavatelů, pokud není uvedeno jinak.
2,2|Zvířata
Samci8-týdenní myši C57BL/6J (20±2g tělesné hmotnosti,n=40) byli získáni od společnosti Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co, LTD. Všechny myši byly krmeny normální stravou a umístěny v cyklu 12-hodina světlo/12-hodina tmy za specifických podmínek bez patogenů (SPF) v Centru laboratorních zvířat lékařského oddělení Univerzity Qingdao . Všechny experimentální postupy na zvířatech byly v souladu s „Příručkou pro péči a používání laboratorních zvířat“, kterou vydaly americké Národní instituty zdraví a politika veřejného zdraví pro humánní péči a používání laboratorních zvířat. Protokoly studie byly schváleny Výborem pro etiku experimentů na zvířatech Univerzity Qingdao (číslo schválení: QYFYWZLL25840).
2,3|Model stárnutí vyvolaného D-gal a podávání léků
Myši byly náhodně rozděleny do pěti skupin (n =8 v každé skupině): kontrola, D-gal, D-gal plus AOS s nízkou dávkou (D-gal plus AOS-50), D-gal plus skupiny AOS se střední dávkou (D-gal plus AOS-100) a D-gal plus s vysokou dávkou AOS (D-gal plus AOS-150). Stárnutí bylo indukováno u C57BL/6J myší subkutánní injekcí D-gal (200 mg/kg, Sigma-Aldrich) po dobu 8 týdnů.23,24 Kontrolním myším byla podána subkutánní injekce ekvivalentní sterilní vody. Čtyři týdny po injekci D-gal byly skupinám D-gal plus AOS-50, D-gal plus AOS-100 a D-gal plus AOS-150 intragastricky podány s AOS ( 50, 100 a 150 mg-kg2-d'l) po dobu dalších 4 týdnů. Kontrolní skupina a myši skupiny D-gal dostaly intragastrickou aplikaci ekvivalentního fyziologického roztoku.
2,4|Echokardiografie
Echokardiografie byla provedena na anestetizovaných myších pomocí Vevo2100 (VisualSonics) s 30-MHz převodníkem na konci experimentu. Následující parametry byly měřeny, jak bylo popsáno dříve: ejekční frakce levé komory (EF) a frakční zkrácení levé komory (FS).25
2,5|Histologická analýza
Vzorky srdce byly fixovány 4% paraformaldehydem po dobu 24 hodin a poté vloženy do parafínu a nařezány na 4-um silné řezy. H&E a Massonovo trichromové barvení byly použity k vizualizaci srdeční architektury a srdeční fibrózy, v daném pořadí. Řezy byly zkoumány pod inverzním světelným mikroskopem (TE 200, Nikon). Odpovídající data byla analyzována a vypočítána výzkumnými pracovníky, kteří byli zaslepeni k přiřazení do léčebných skupin.
2,6|Transmisní elektronová mikroskopie
Ultrastruktura mitochondrií byla stanovena pomocí transmisní elektronové mikroskopie. Po předchozí studii bylo 26 čerstvých tkání levé komory nařezáno na 1 mm³ bloky a fixováno ve 2,5% glutaraldehydu po dobu 2 hodin při 4 stupních. Po následné fixaci v 1% oxidu osmičelého po dobu 2 hodin při teplotě místnosti byly tkáně levé komory dehydratovány a poté uloženy do pryskyřice. Sériové ultratenké řezy (30-40 nm) byly shromážděny na měděné mřížky a nakonec obarveny 0,5 procenta octanu uranylu následovaného 1 procentem citrátu olovnatého. Ultrastrukturální analýza obarvených řezů byla stanovena pomocí transmisní elektronové mikroskopie Tecnai G2 12 (FEI Co.).
2,7|Stanovení mitochondriálního membránového potenciálu (MMP).
Potenciál mitochondriální membrány byl měřen pomocí JC-1 imunofluorescenčního barvení a průtokové cytometrie. Čerstvé srdeční tkáně byly použity k přípravě zmrazených řezů nebo extrakci mitochondrií. Zmrazené řezy byly použity pro imunofluorescenční barvení JC-1 podle protokolu výrobce.výhody cistanche salsyFluorescence byla stanovena při excitaci/emise 485/580 nm (červená) a excitaci/emise 485/530 nm (zelená) pomocí fluorescenčního mikroskopu.
Kromě toho byly mitochondrie izolovány z čerstvé srdeční tkáně pomocí mitochondriální extrakční soupravy podle metody publikované Peng et al.' Extrahované mitochondrie byly poté použity k detekci integrity MMP měřením fluorescenční intenzity JC{ {2}}. Stručně řečeno, mitochondrie byly inkubovány s JC-1 v JC-1 testovacím pufru po dobu 10 minut při pokojové teplotě. K narušení MMP byl aplikován karbonylkyanid m-chlorfenylhydrazon a sloužil jako pozitivní kontrola podle pokynů výrobce. Vzorky byly analyzovány při 488 a 575 nm průtokovou cytometrií za použití CellQuest Software (Becton Dickinson).
2,8|Měření počtu kopií mtDNA
Počet kopií mitochondriální DNA byl měřen pomocí kvantitativní PCR v reálném čase (qPCR). Stručně řečeno, srdeční tkáně byly homogenizovány a odstraněny proteiny a RNA pomocí proteinázy K a RNázyA. Celková DNA byla extrahována soupravou TIANamp Genomic DNA kit a poté kvantifikována spektrofotometrem QuickDrop od Molecular Devices (Holliston, MA). K amplifikaci mtDNA vzorku pomocí fluorescenčního PCR detekčního systému (Hangzhou Bioer Technology Co. Ltd.) byla použita souprava PCR sondy myší mtDNA. Počet kopií mtDNA byl vypočten z křivky pozitivní kontroly qPCR podle protokolu výrobce.
2,9|In situ detekce produkce ROS
Jak bylo popsáno dříve, fluorescenční barvení DHE bylo provedeno za účelem vyhodnocení úrovně produkce ROS in situ.2³ Stručně, čerstvé srdeční tkáně byly vloženy do sloučeniny OCT a poté okamžitě zmraženy pomocí kryostatu na -20 stupeň. Zmrazené srdeční tkáně byly nařezány na 6-um tlustá histologická sklíčka. Plátky srdce byly promyty 1x fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) a poté inkubovány s roztokem DHE (5 umol/l) ve zvlhčené komoře chráněné před světlem při 37 stupních po dobu 30 minut. Po inkubaci byly příčné srdeční řezy opláchnuty 1 x PBS. Nakonec byly snímky získány fluorescenčním mikroskopem a intenzita fluorescence byla kvantifikována pomocí softwaru ImageJ slepým testerem.
2.10|Měření peroxidace lipidů
Jako hlavní sekundární oxidační produkty peroxidace lipidů byla měřena koncentrace malondialdehydu (MDA) v homogenátech séra a srdce podle instrukcí sady MDA Assay (Jiancheng Bioengineering Institute).
2.11|Western blot analýza
Srdeční tkáně byly homogenizovány v RIPA pufru obsahujícím inhibitory fosfatázy a proteázy a centrifugovány při 12 00 rpm při 4 stupních po dobu 20 minut. Poté byl supernatant odebrán pro následující experimenty. Koncentrace proteinu byla stanovena pomocí soupravy pro stanovení proteinu BCA. Stejná množství proteinů byla umístěna do 10% SDS-PAGE gelu a přenesena na PVDF membrány (Roche). Membrány byly blokovány těsnícím roztokem po dobu 1 hodiny a inkubovány s odpovídajícími primárními protilátkami při 4 stupních přes noc. Poté byly membrány promyty v TBS-T a inkubovány s vhodnými sekundárními protilátkami. Následně byly membrány promyty v TBS-T a vizualizovány za použití detekčních činidel ECL Western blotting (Bio-Rad). Exprese proteinu byla kvantifikována denzitometrickou analýzou pásů pomocí softwaru ImageJ. Jako kontrola nanášení byl použit provozní protein GAPDH. Poměry ředění primární a sekundární protilátky byly ukázány následovně: ANP(1:1000),BNP(1:2000),p53(1:1000),p21 (1:1000),PGC-1 a (1:1000),SIRT3(1:1000),beclin-1(1:1000),p-mTOR(1:1000),mTOR (1:1000),p47-phox( 1:500),p67-phox(1:1000),gp91-phox(1:2000), GAPDH (1:2000), kozí anti-králičí IgG (H ＋ L)(peroxidáza /HRP konjugovaný) (1:5000) a kozí anti-myší IgG (H＋L) (peroxidáza/HRP konjugovaný) (1:5000).
2.12|Statistická analýza
Data byla vyjádřena jako průměr ± SEM. Statisticky významná byla stanovena pomocí jednocestné ANOVA následované Student-Newman Keulsem (SNK) post hoc testem.<.05 was="" considered="" to="" be="" statistically="">
3|VÝSLEDEK
3,1|Účinky AOS na srdeční funkci a expresi markerů stárnutí u stárnoucích myší vyvolaných D-gal
Echokardiografie byla použita k analýze srdeční funkce myší. Stárnoucí myši indukované D-gal vykazovaly významný pokles v procentech EF a procentech FS. AOS však významně zabránil srdeční dysfunkci u stárnoucích myší vyvolaných D-gal, včetně částečně zachovaných procent EF a procent FS (obrázek 1A-C). Jak je znázorněno na obrázku 1D-G, nebyl mezi každá skupina. Myši s D-galaktózou měly tendenci zvyšovat LVEDD (levé ventrikulární end-diastolický průměr) a LVPWd (tloušťka zadní stěny levé komory na konci diastoly), ale nebyl zde žádný statisticky významný rozdíl ve srovnání s kontrolními myšmi. LVESD (levé ventrikulární end-systolický průměr) byl však významně zvýšen u stárnoucích myší vyvolaných D-gal a AOS snižoval LVESD způsobem závislým na dávce. Exprese ANP a BNP v srdeční tkáni byla stanovena Western blotem pro další ověření srdeční funkce myší v každé skupině. Jak je znázorněno na obrázku 1H-I, hladiny ANP a BNP byly významně zvýšeny u stárnoucích myší vyvolaných D-gal a AOS významně snížily hladiny ANP a BNP způsobem závislým na dávce. Tyto údaje ukázaly, že AOS zabránil srdeční dysfunkci u stárnoucích myší vyvolaných D-gal. Dále jsme detekovali proteinovou expresi markerů stárnutí p53 a p21. Jak se očekávalo, exprese proteinu p53 a p21 byla významně zvýšena v srdečních tkáních stárnoucích myší vyvolaných D-gal a AOS významně snížila expresi p53 a p21 způsobem závislým na dávce (obrázek 1J-K).
3,2|Účinek AOS na srdeční histopatologické změny u stárnoucích myší vyvolaných D-gal
Ke zkoumání změn architektury myokardu u myší byla sklíčka srdeční tkáně obarvena hematoxylinem a eosinem (H&E). Jak je znázorněno na obrázku 2A, ve srovnání s kontrolními myšmi vykazovaly stárnoucí myši vyvolané D-gal abnormální architekturu myokardu, charakterizovanou především neuspořádaným uspořádáním kardiomyocytů a zvětšeným mezibuněčným prostorem mezi buňkami. Podávání AOS významně snížilo neuspořádané uspořádání a prostor mezi kardiomyocyty. H&E barvení také ukázalo, že oblast kardiomyocytů levé komory byla významně zvýšena u stárnoucích myší vyvolaných D-gal a léčba AOS významně snížila oblast kardiomyocytů způsobem závislým na dávce (obrázek 2B, D).
Aby se objasnil stupeň srdeční fibrózy, bylo provedeno Massonovo trichromové barvení průřezů srdce. Jak je znázorněno na obrázku 2C,E, akumulace kolagenu v intersticiálních a perivaskulárních oblastech myokardu se dramaticky zvýšila u stárnoucích myší vyvolaných D-gal. Ve srovnání se skupinou D-gal však léčba AOS významně snížila procento kolagenové oblasti v závislosti na dávce (obrázek 2C, E). Tato data naznačují, že AOS zabránil D-gal-indukovaným morfologickým změnám a srdeční fibróze u myší C57BL/6J.
3,3|Vliv AOS na srdeční mitochondriální ultrastrukturu stárnoucích myší vyvolaných D-gal
Dále jsme použili transmisní elektronovou mikroskopii k detekci alterace srdeční mitochondriální ultrastruktury. Jak je znázorněno na obrázku 3, mitochondrie kardiomyocytů kontrolních myší byly strukturálně normální a vykazovaly jasně rozeznatelné kristy a elektronově prosvítající matrici. Některé mitochondrie kardiomyocytů D-gal myší byly zvětšené, otoky a částečná ztráta krist a léčba AOS zabránila destrukci srdeční mitochondriální ultras-struktury u stárnoucích myší vyvolaných D-gal.
3,4|Účinek AOS na srdeční MMP u stárnoucích myší vyvolaných D-gal
Jako důležitý determinant funkčního stavu mitochondrií byla MMP měřena pomocí JC-1 fluorescenčního barvení a průtokové cytometrie. Obecně platí, že když je membránový potenciál mitochondrií vysoký, JC-1 agreguje v mitochondriích a emituje červenou fluorescenci, zatímco JC-1 existuje jako monomer v cytosolu a emituje zelenou fluorescenci, když mitochondrie s nízkým membránovým potenciálem.29 Takže poměr červené fluorescence k zelené fluorescenci by mohl odrážet intenzitu MMP. Jak je znázorněno na obrázku 4A-B, výsledek fluorescenčního barvení JC-1 ukázal, že hladina srdeční MMP u stárnoucích myší vyvolaných D-gal byla dramaticky nižší než u kontrolních myší a podávání AOS chránilo proti D- galaktózou zprostředkovaný pokles MMP. v
3,5|Vliv AOS na mitochondriální biogenezi a expresi autofagického proteinu v srdcích stárnoucích myší vyvolaných D-gal
Použili jsme Western blot ke stanovení proteinové exprese mi-tochondriálního markeru biogeneze PGC-1a. Jak se očekávalo, významný pokles exprese proteinu PGC-1o byl pozorován v srdečních tkáních stárnoucích myší vyvolaných D-gal a AOS významně zvýšilo expresi PGC-1a v závislosti na dávce způsobem (obrázek 5A-B). Studie ukázaly, že SIRT3 hraje důležitou roli při udržování mitochondriální bioenergetiky. Proto jsme dále detekovali expresi SIRT3 v srdečních tkáních. Náš výsledek ukázal, že významný pokles exprese proteinu SIRT3 u stárnoucích myší vyvolaných D-gal a AOS významně zvýšil expresi proteinu SIRT3 způsobem závislým na dávce (obrázek 5C-D). Kromě toho výsledek PCR sondy mtDNA ukázal, že počet kopií mtDNA byl významně snížen u stárnoucích myší vyvolaných D-gal a AOS významně zvýšil počet kopií mtDNA v závislosti na dávce (obrázek 5E). Tato data ukázala, že AOS up-reguloval mitochondriální biogenezi u stárnoucích myší vyvolaných D-gal.
Dále jsme použili Western blot k určení exprese a fosforylace kritických autofagických regulátorů v srdečních tkáních. Jak je znázorněno na obrázku 5F-I, v srdečních tkáních stárnoucích myší vyvolaných D-gal bylo pozorováno významné snížení exprese proteinu beclin{2}} a významné zvýšení fosforylace mTOR. Jak se očekávalo, AOS významně zvýšil expresi beclin{5}} a snížil fosforylaci mTOR způsobem závislým na dávce.
3,6|Vliv AOS na produkci ROS a oxidační stres v srdcích stárnoucích myší vyvolaných D-gal
Produkci ROS v srdcích jsme stanovili pomocí fluorescenčního barvení DHE. Jak je znázorněno na obrázku 6A-B, zjistili jsme, že intenzita fluorescence DHE kardiomyocytů levé komory byla významně zvýšena u stárnoucích myší vyvolaných D-gal a AOS významně snížila intenzitu fluorescence DHE kardiomyocytů levé komory.
Abychom prozkoumali účinek AOS na stav oxidačního stresu v srdcích stárnoucích myší vyvolaných D-gal, použili jsme Western blot ke stanovení proteinové exprese NADPH oxidázy v srdečních tkáních. Exprese podjednotky NADPH oxidázy p47-phox,p{4}}phox a gp91-phox byla významně zvýšena u stárnoucích myší vyvolaných D-gal. AOS však snižoval expresi těchto podjednotek NADPH oxidázy způsobem závislým na dávce (obrázek 6C-D).
Protože MDA je považován za předpokládaný biomarker peroxidace lipidů v živých organismech, dále jsme detekovali koncentraci MDA pro hodnocení stavu oxidačního stresu in vivo. Jak je znázorněno na obrázku 6E-F, zvýšený stav oxidačního stresu u stárnoucích myší vyvolaných D-gal byl potvrzen vyšší koncentrací MDA v homogenátech séra a srdce. Podání AOS snížilo hladiny MDA v závislosti na dávce ve srovnání se skupinou D-gal. Souhrnně tato data naznačovala, že AOS významně snížila produkci ROS a stav oxidačního stresu u stárnoucích myší vyvolaných D-gal.
4|DISKUSE
Stárnutí je chronické systémové změny organismu související s mnoha orgány. Rostoucí kardiovaskulární onemocnění související s věkem a následná finanční zátěž se staly převládající celosvětovou výzvou.30,31 Proto je třeba hloubkově prostudovat molekulární mechanismy stárnutí srdce a nové intervence proti stárnutí budou mít velký význam v zlepšení zdravotního stavu a také oddálení srdeční nedostatečnosti způsobené stárnutím.
Alginát je lineární kopolymer polysacharidů extrahovaný z hnědých mořských řas. Vzhledem ke své vysoké molekulové hmotnosti a viskozitě je pro alginát obtížné procházet buněčnými membránami a biologickými bariérami, což omezuje jeho využití. AOS, odvozený z hydrolýzy alginátu, přitahuje stále větší pozornost kvůli své nižší molekulové hmotnosti a viskozitě. AOS je ve vodě rozpustná, netoxická, neimunogenní a biologicky odbouratelná sloučenina a má mnohem lepší biologické aktivity než alginát.“ Důkazy naznačují, že AOS jako antioxidační oligosacharid má schopnost chránit neurodegenerativní onemocnění a akutní kardiotoxicitu doxorubicinu prostřednictvím inhibice stresu endoplazmatického retikula a oxidativního stresu.5 Nedávné studie ukázaly, že AOS pocházející z moře vykazuje slibnou biologickou aktivitu při snižování hyperlipidémie, hyperglykémie a hypertenze a potlačující obezitu.27 Schopnost AOS chránit před stárnutím však nebyla prokázána.
Předchozí studie naznačují, že stárnoucí srdce vykazuje jedinečné histologické a funkční rysy, včetně progresivního přemodelování srdce a zhoršující se srdeční rezervy.25,32 Vnitřní stárnutí srdce může nakonec vést ke zvýšené zranitelnosti vůči různým stresorům a podporovat rozvoj kardiovaskulárních onemocnění. . Modely předčasného stárnutí vyvolané D-gal vykazují podobné fenotypy srdečních změn ve srovnání s přirozeným stárnutím u hlodavců.*4 V této studii jsme prokázali, že stárnutí myší vyvolané D-gal vykazovalo abnormální architekturu myokardu a zvýšenou akumulaci kolagenu v intersticiálním myokardu. a perivaskulární oblasti a podávání AOS inhibovalo srdeční remodelaci indukovanou D-gal u myší C57BL/6J. Mezitím jsme zjistili, že AOS zabraňuje srdeční dysfunkci u stárnoucích myší vyvolaných D-gal, včetně částečně zachovaných procent EF a procent FS, a snižuje expresi ANP a BNP. Echokardiografie byla také použita k analýze změn srdeční struktury myší. D-galaktózové myši měly tendenci zvyšovat LVEDD a LVPWd, ale nebyl zde žádný statisticky významný rozdíl ve srovnání s kontrolními myšmi. LVESD však byla významně zvýšena u stárnoucích myší vyvolaných D-gal a AOS snižovala LVESD způsobem závislým na dávce. Důvodem tohoto jevu může být to, že model zrychleného stárnutí napodobující D-galaktózu má relativně krátkou dobu modelování, což ovlivňuje hlavně mitochondriální funkci, jak je uvedeno níže, a vede k srdeční dysfunkci. Docházelo k velkým změnám struktury srdce, ale nevedly ke statisticky významným rozdílům. Kromě toho naše data také ukázala, že podávání AOS významně snížilo expresi markerů stárnutí p53 a p21 v závislosti na dávce. Aby bylo možné dále prozkoumat možné mechanismy přispívající k ochranné schopnosti AOS proti stárnutí, byl analyzován mitochondriální kompromis související s věkem.
Srdce obsahuje četné mitochondrie na základě jeho mimořádné-dinární poptávky po ATP. Mitochondrie generují ATP prostřednictvím oxidativní fosforylace mastných kyselin a sacharidů. Během tohoto procesu navíc neustále vznikají volné radikály. Stojí za zmínku, že mitochondriální homeostáza je životně důležitá pro udržení funkce a životaschopnosti kardiomyocytů.3 stupeň Nezávislé studie na stárnoucím srdci skutečně ukázaly, že mitochondrie kardiomyocytů se během stárnutí zhoršují.3738 Ultrastrukturální morfometrická analýza starých hlodavců myokard vykazuje přítomnost zvětšených a otoků mitochondrií s poruchou ma-trix a ztrátou krist." V této studii byly ve srovnání s kontrolními myšmi některé mitochondrie kardiomyocytů D-gal myší zvětšené, otoky a částečná ztráta krist. Léčba AOS zmírnila destrukci srdeční mitochondriální ultrastruktury u stárnoucích myší vyvolaných D-gal. Paralelně s tím D-gal indukoval významný pokles hladiny srdeční MMP a podávání AOS chránilo před D-gal zprostředkovaným Tyto výsledky ukázaly, že AOS zabránila zničení srdečních mitochondrií u stárnoucích myší vyvolaných D-gal.
Bylo zaznamenáno, že v patogenezi stárnoucího srdce, včetně změny mitochondriální biogeneze a odstranění, se podílejí četné kompromitované mitochondriální procesy. Mezitím mitochondriální dysfunkce a zhoršené odstraňování zničených mi-tochondrií zase zvyšují zranitelnost starého srdce vůči stresovému poškození." Mitochondriální biogeneze je regulována především sadou jaderně kódovaných koaktivátorů a transkripčních faktorů. Peroxisomový proliferátorem aktivovaný receptor y Bylo prokázáno, že koaktivátor 1a (PGC{4}}a), který je kritický pro udržení energetické homeostázy, hraje klíčovou roli při regulaci mitochondriální biogeneze a funkce.4 Snížená exprese a aktivita PGC-1byly spojeny na stárnutí srdce a srdce a rozvoj srdečního selhání.“2 Předchozí studie ukazuje, že aktivace p53 související s věkem přímo vede k mi-tochondriálnímu kompromisu prostřednictvím potlačení několika hlavních regulátorů mitochondriální biogeneze, včetně PGC-1a. 43 Hromadící se linie důkazů také naznačují, že aktivace PGC-1o farmakologickým nebo genetickým zásahem zabraňuje změnám v srdci souvisejícím se stárnutím.“ Sirtuiny (SIRT) jsou uznávané jako nepostradatelné regulátory procesu stárnutí. SIRT3, lokalizovaný v mitochondriální matrix, hraje důležitou roli při udržování mitochondriální bioenergetiky, modulaci mitochondriálního metabolismu a regulaci celého života. Ukázalo se, že nedostatek Sirt3 vede k srdečním abnormalitám a zhoršuje mitochondriální bioenergetiku u myší. 45 V této studii jsme ukázali, že významný pokles exprese proteinů PGC-1a a SIRT3 byl pozorován v srdečních tkáních stárnoucích myší vyvolaných D-gal a AOS významně zvýšilo PGC-1a a exprese proteinu SIRT3 způsobem závislým na dávce. Kromě toho výsledek PCR sondy mtDNA ukázal, že počet kopií mtDNA byl významný pokles u stárnoucích myší vyvolaných D-gal a AOS významně zvýšil počet kopií mtDNA v závislosti na dávce. Celkově vzato tato data naznačovala, že AOS up-reguloval mitochondriální biogenezi u stárnoucích myší vyvolaných D-gal.
Jak bylo uvedeno výše, účinné odstranění poškozených mitochondrií je životně důležité pro udržení homeostázy kardiomyocytů. Známým mechanismem, kterým dochází k přeměně mitochondrií, je autofagie. Předpokládá se, že autofagie hraje kritickou roli v regulaci srdeční homeostázy v bazálním stavu i v reakci na stres.46,47 Autofagie je však obecně ve stárnoucím srdci regulována směrem dolů. Nižší úroveň autofagie během procesu stárnutí snižuje degradaci zničených organel a toxických proteinů a indukuje akumulaci dysfunkčních a abnormálních mitochondrií, které nakonec vyústí v globální srdeční dysfunkci. Bylo prokázáno, že stimulace autofagie zlepšuje srdeční funkci u modelů hlodavců odstraněním dysfunkčních mitochondrií, čímž optimalizuje celkové buněčné prostředí a nakonec zmírňuje patologii související se stárnutím v srdci.48 V této studii jsme prokázali, že úroveň autofagie se významně snížila v srdci tkání D-gal-indukovaných stárnoucích myší a AOS významně zvýšily úroveň autofagie způsobem závislým na dávce. Tyto změny odhalily, že AOS zvýšil účinné odstranění mitochondrií s věkem prostřednictvím up-regulace autofagie. Jak již bylo diskutováno, velká část produkce ROS, generovaná komplexy mitochondriálního elektronového transportního řetězce (ETC), vzniká jako vedlejší produkt mitochondriální oxidativní fosforylace.4 Experimentální důkazy naznačují, že poškozené mitochondrie v průběhu stárnutí generují zvýšené množství ROS, zesilují poškození způsobené volnými radikály a nakonec vedou k progresivní spirále mitochondriálního rozpadu s dopřednou zpětnou vazbou.4 To zase indukuje více ROS poškozením ETC, indukuje další produkci ROS a nakonec vede k selhání bioenergetiky . Kromě ETC je hlavním extramitochondriálním zdrojem ROS nikotinamid adenindinukleotid fosfát (NADPH) oxidáza, která může být zodpovědná za oxidační stres během procesu stárnutí a zhoršit oxidační poškození mitochondrií. Kromě těchto mechanismů nedávná studie také ukázala, že nižší mitochondriální tvorba ROS přispívá k produkci nízké úrovně poškození mtDNA v ustáleném stavu. obecné přispívá k jejich vynikající dlouhověkosti. Nedávná zpráva ukazuje, že inhibitor NADPH oxidázy potlačuje mitochondriální dysfunkci ve ventrálním kochleárním jádru stárnoucích potkanů vyvolaných D-gal. MDA je považován za předpokládaný biomarker peroxidace lipidů v živých organismech a koncentrace MDA může být použita k hodnocení stavu oxidačního stresu in vivo. V této studii jsme zjistili, že podávání AOS zeslabilo produkci ROS, snížilo expresi NADPH oxidázy a snížilo hladinu MDA u stárnoucích myší vyvolaných D-gal. Naše současné výsledky naznačují, že AOS účinně snižuje stav oxidačního stresu u stárnoucích myší vyvolaných D-gal, což může být dalším důležitým ochranným faktorem pro AOS ke zmírnění poškození mitochondrií.
V této studii jsme nejprve objasnili, že AOS zmírňuje stárnutí srdce vyvolané D-gal zlepšením mitochondriální biogeneze, zachováním mitochondriální integrity a zvýšením účinného odstranění poškozených mitochondrií u myší C57BL/6J. Kromě toho AOS také snižuje produkci ROS a stav oxidačního stresu, což zase dále inhibuje zničení srdečních mitochondrií. AOS může být účinným terapeutickým činidlem ke zmírnění srdečního stárnutí. V této studii jsme použili pouze samce myší a nezkoumali jsme rozdíly mezi pohlavími na účinky AOS. Je velmi zajímavé, že intercelulární adhezní molekula specifická pro dendritické buňky-3- pohlcující neintegrinový (DC-SIGN) ligand 1 (DSCL1, protizánětlivá látka) léčba snižuje polarizaci makrofágů a diastolickou dysfunkci u stárnoucího ženského, ale nikoli samčího myšího srdce.52 Tato práce naznačuje, že by bylo velmi důležité porovnat rozdíly mezi pohlavími v budoucích studiích.
Na závěr naše zjištění naznačují, že AOS zmírnil stárnutí srdce vyvolané D-gal prostřednictvím regulace funkce a integrity mitochondrií myokardu u myší. AOS vykazuje širokou škálu slibných biologických aktivit a může být účinným terapeutickým prostředkem ke zmírnění srdečního stárnutí.
Tento článek je převzat z J Cell Mol Med. 2021;25:7157–7168. wileyonlinelibrary.com/journal/jcmm|7157
