Alkoholově specifická transkripční dynamika opětovné konsolidace paměti a relapsu, část 4

Kromě Arc jsme zjistili, že hladiny mRNA Egr1, ale ne Bdnf, byly zvýšeny v DH a mPFC vyhledáváním paměti alkoholem.

Jak čas plyne, lidé postupně získávají nové chápání tajemství zapomnění. V tomto procesu se nová technologie načítání paměti postupně stala aktivním bodem výzkumu.

Existuje tedy vztah mezi získáváním paměti po alkoholu a výkonností paměti? Přijďte se nyní podívat! Nejprve si musíme ujasnit: Vybavování paměti alkoholem není samostatnou technologií. Jde o technologii, která ovlivňuje mozkové neurony prostřednictvím alkoholu. Tento proces může aktivovat některé „spící“ vzpomínky v mozku, což nám umožňuje tyto vzpomínky obnovit.

Za druhé, musíme vědět, že zlepšování paměti nám jednoduše neumožňuje „pamatovat si“ více věcí, ale je to proces získávání a rekonstrukce vzpomínek různými způsoby. Tento proces nám může pomoci lépe upevnit a pochopit znalosti, které jsme se naučili, a tím zlepšit naši paměť.

Proto můžeme dojít k závěru, že existuje vztah mezi získáváním paměti po alkoholu a výkonností paměti. Když použijeme tuto technologii k opětovnému vytažení předchozích vzpomínek po požití alkoholu, procházíme procesem opětovného konsolidace těchto vzpomínek, čímž se naše paměť do určité míry zlepšuje.

Samozřejmě musíme také poznamenat, že vyhledávání paměti alkoholem není dlouhodobá a spolehlivá technika pro zlepšení paměti. Chceme-li mít výbornou paměť po dlouhou dobu, musíme si paměť průběžně upevňovat a zlepšovat každodenním studiem a životem v kombinaci s dalšími technikami trénování paměti.

V tomto procesu si musíme neustále udržovat optimistický přístup, abychom lépe stimulovali naši motivaci k učení a paměťový potenciál. Postavme se proto trénování paměti aktivně, buďme neúnavně sami sebou a vykročme odvážně vpřed na cestě neustálého zlepšování paměti! Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche deserticola dokáže výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche deserticola dokáže regulovat i rovnováhu neurotransmiterů, jako je zvýšení hladiny acetylcholinu a růstových faktorů. Tyto látky jsou velmi důležité pro paměť a učení. Kromě toho může maso také zlepšit průtok krve a podpořit dodávku kyslíku, což může zajistit, že mozek dostane dostatek živin a energie, a tím zlepší mozkovou vitalitu a vytrvalost.

Kliknutím nyní zlepšíte krátkodobou paměť

Zvýšená exprese mRNA Egr1 byla dříve zapojena do opětovné konsolidace vzpomínek na strach a drogy [19, 21, 48, 61], což zvyšuje možnost, že tento transkripční faktor také hraje roli při opětovné konsolidaci vzpomínek na alkohol.

Zatímco role Bdnf při rekonsolidaci paměti zůstává kontroverzní [19, 49], je známo, že indukce Bdnf je klíčová pro učení osvojování a zániku paměti [19, 62]. Nedostatečná změna exprese Bdnf v naší studii by tedy mohla naznačovat, že náš postup vyhledávání paměti nezahájil učení extinkce paralelně s vyhledáváním paměti.

Kromě toho jsme nedávno uvedli, že ačkoli hladiny mRNA Bdnf v DH nejsou zvýšeny vyhledáváním alkoholové paměti jako takovým, exprese růstového faktoru byla zvýšena, když po vyhledávání následovalo averzivní kontrakondicionování, které zabránilo relapsu [44], což naznačuje komplexní roli Bdnf v dynamice paměti alkoholu.

Naše zjištění naznačují, že zvýšení exprese IEG není jedinečné pro opětovné konsolidace vzpomínek souvisejících s alkoholem.

ARC a EGR1 byly dříve zapojeny do konsolidace několika typů vzpomínek, včetně vzpomínek strachu [19, 46, 47, 62], rozpoznávacích vzpomínek [21] a vzpomínek spojených s různými návykovými látkami [20, 22, 61].

Existuje však také stále více důkazů, že některé z mechanismů, které jsou základem hledání alkoholu, se mohou lišit od těch, které řídí přirozené hledání odměny [5, 27, 28, 63]. Existuje také důkaz, že vzpomínky na různé odměny (a zejména na různé drogy) jsou zpracovány rozdílně [29–32]. Naše zjištění analýzy RNAseq skutečně odhalila jedinečný transkriptomický podpis vyvolaný vyhledáváním paměti po alkoholu.

Konkrétně jsme našli 44 genů v DH a jinou sadu 9 genů v nich PFC, které vykazovaly významné změny po získání alkoholové paměti. Po další validaci dat jsme se zaměřili na jeden gen v mPFC (Fkbp5) a tři geny v DH (Adcy8, Scl8a3 a Neto1) a zjistili jsme, že jejich exprese nebyla ovlivněna vyhledáváním vzpomínek spojených se sacharózou.

To naznačuje, že na rozdíl od Arc a Egr1 tyto 4 specifické geny pravděpodobně nehrají obecnou roli při zpracování vzpomínek na odměnu, ale mohou spíše hrát selektivní role při zpracování alkoholových vzpomínek.

Je zajímavé, že tyto čtyři geny byly dříve zapleteny do poruchy užívání alkoholu a učení a paměti. Fkbp5 tedy kóduje FK506 vazebný protein 5, regulátor stresového neuroendokrinního systému [64].

Varianty FKBP5 modulují závažnost alkoholového abstinenčního syndromu [65] a predikují sklon k nadměrnému pití u lidí [66–68]. Bylo prokázáno, že delece Fkbp5 zvyšuje závažnost abstinenčních příznaků [65] a pití alkoholu [67] u myší, zatímco farmakologická inhibice proteinu snížila mírnou konzumaci alkoholu a obnovení CPP u myší [69] a snížilo pití alkoholu u stresovaných samců potkanů ​​[70].

Hladiny mRNA Adcy8, kódující adenylatecyklázu 8 (AC8), která katalyzuje tvorbu cAMP v reakci na příliv vápníku a která byla nedávno označena za možný regulátor příjmu alkoholu [28, 71], byly sníženy v krvinkách dlouhodobě abstinujících alkoholiků [72].

Již dříve bylo prokázáno, že delece Adcy8 snižuje pití alkoholu a zvyšuje citlivost na sedativní účinky alkoholu u myší [73]. Kromě toho chronická expozice alkoholu u potkanů ​​upregulovala mozkovou expresi rodiny nosičů solutů 8 (výměnník sodík/vápník), člen 3 (NCX3), proteinu kódovaného Scl8a3 [74, 75].

Konzumace alkoholu u potkanů ​​byla také spojena se sníženou expresí Neto1 v mozkovém kmeni [76], který kóduje neuropilin tolloid-like 1 (NRP1), složku komplexu NMDA-receptor [77].

Tento protein se podílí na synapticreorganizaci a přenosu v hipokampu [78] a je nezbytný pro prostorové učení a paměť [77].

Naše zjištění tedy ukazují, že pouhé načtení alkoholových vzpomínek, dokonce bez jakýchkoli farmakologických účinků alkoholu, ovlivňuje expresi těchto genů. Jejich specifickou roli při rekonsolidaci alkoholové paměti a relapsu však zbývá otestovat.

Omezením této studie je, že test RNA-seq byl proveden na hromadných tkáních mPFC a DH, spíše než na jednotlivých buňkách aktivovaných vyvoláním paměti. Konkrétně nedávné studie naznačují, že vzpomínky obecně [79, 80] a konkrétně vzpomínky související s alkoholem [32, 81, 82] jsou kódovány prostřednictvím aktivace neuronových souborů složených z malého počtu neuronů, které lze identifikovat pomocí markerů neuronální aktivace ( např. cFOS) [80].

V mPFC a dalších mesolimbických oblastech v mozku potkana byly skutečně nalezeny podobné vzorce aktivace IEG (cFOS) vyhledáváním operantem podmíněných vzpomínek na alkohol a sladkou odměnu [32, 81]. Je tedy možné, že provedení RNA-seq testu selektivně na neuronální soustavě aktivované načítáním paměti by poskytlo přesnější výsledky.

Stručně řečeno, naše zjištění naznačují, že vyhledávání alkoholové paměti vyvolává dva paralelní transkripční programy. Jeden program, přenášený prostřednictvím běžných molekulárních mechanismů učení a paměti, včetně IEG Arc a Egr1, se obecně zabývá konsolidací vzpomínek.

Druhý transkripční program, spuštěný vyhledáváním alkoholové paměti, je řízen geny, které specificky podporují chování související s alkoholem. Tento model duálního zpracování vzpomínek na alkohol zvyšuje možnost, že rekonsolidace paměti pro různé vzpomínky může mít podobné molekulární mechanismy duálního zpracování, přičemž některé složky sdílí více pamětí a jiné jsou jedinečné pro každý typ paměti.

Tento hypotetický model je třeba ještě posoudit testováním, zda manipulace s těmito geny ovlivní rozdílně rekonsolidaci paměti alkoholu a sacharózy. Pokud ano, naznačovalo by to, že by mohlo být možné zaměřit se na molekulární cíle specifické pro odměnu k léčbě poruch souvisejících s patogenními vzpomínkami, jako je závislost, spíše než narušit hlavní molekulární mechanismy, které jsou nezbytné pro mnoho funkcí mimo znovukonsolidaci alkoholové paměti.

MATERIÁLY A METODY

Podrobnosti o přístroji, lécích a reagenciích, návrhu a přípravě oligodeoxynukleotidů (ODN), analýzách westernblot a qRT-PCR a přípravě knihovny RNA-seq najdete v Doplňkových informacích.

Zvířata

Samci a samice myší C57BL/JRccHsd (25–30 g), chovaní po 3–4 v kleci, byli chováni v Tel-Aviv University Animal Facility (Izrael) a chováni v 12hodinovém cyklu světlo-tma (světla zapnutá v 7:00), s potravou a vodou dostupnou adlibitum.

V experimentech zahrnujících úpravu sacharózového místa byl přístup k potravě omezen na 6 hodin před tréninkem, aby se zvýšila motivace myší sbírat sacharózové pelety. Toto krátké trvání potravinové deprivace je založeno na zjištěních, že během dne 2–6hodinové hladovění neovlivňuje stravovací chování [83] a nespouští významný posun inmetabolických markerů [84], čímž se minimalizují účinky restrikce potravy. .

Myši byly váženy dvakrát týdně pro kontrolu úbytku hmotnosti. Všechny experimentální protokoly byly schváleny a vyhověly pokynům Institucionálního výboru pro péči o zvířata a použití na univerzitě v Tel Avivu a pokynům NIH (číslo záruky dobrých životních podmínek zvířat A5010-01). Veškeré úsilí bylo vynaloženo na minimalizaci počtu použitých zvířat.

Behaviorální postupy

Místo klimatizace

Alkoholem podmíněné místo preference (CPP): Všechny myši byly zvyklé na denní ip injekce fyziologického roztoku po dobu 3 dnů.

Základní test (den 1): První den byly posuvné dveře zataženy a myši mohly volně prozkoumávat celé zařízení po dobu 30 minut. Kondicionování alkoholem (dny 2–9): Trénink začal 24 hodin po základním testu jedním sezením podávané denně po dobu 8 dnů se zavřenými posuvnými dveřmi. 3., 5., 7. a 9. den myši dostaly alkohol (1,8 g/kg, 20 % v/v; ip) a byly okamžitě uzavřeny do spárovaného oddílu po dobu 5 minut.

Již dříve bylo prokázáno, že tato dávka a trvání kondicionování produkují alkoholem indukovaný CPP [42, 85]. Každý druhý den (tj. dny 2, 4, 6 a 8) myši dostaly fyziologický roztok a byly uzavřeny v nepárovém oddělení po stejnou dobu jako v den kondicionování alkoholem.

Párové kompartmenty byly vyváženy. Test preference místa 1 (den 10): Test preference místa byl takový, jak je popsáno pro základní test, a sloužil k indexování alkoholu-CPP [41]. Preference byla definována jako zvýšení procenta času stráveného v oddělení s alkoholem během testu preference místa 1 ve srovnání se základním testem.

Vyhledání paměti (den 11): Před touto fází byly myším přiřazeny různé experimentální podmínky (shodné pro skóre CPP a pohlaví). Během relace získávání paměti byly myši na 3 minuty uzavřeny v oddělení s alkoholem a poté vráceny do svých domovských klecí. Kontrolní myši byly krátce ošetřeny. Test preference místa 2 (den 12): Myši byly podrobeny testu preference místa identickému s testem preference místa 1.

Sacharóza CPP: Předtrénink sacharózy (1.–6. den): 1.–3. den si myši zvykly sbírat 5–6 sacharózových pelet (45 mg, Dustless PrecisionPellets, Bio-Serv, Frenchtown, NJ, USA) v domácích klecích . Ve dnech 4–6 byly myši trénovány tak, aby během 30-minutových sezení shromáždily 3 pelety do prázdné krabice z plexiskla. Myši, které nasbíraly méně než šest pelet (z celkového počtu devíti pelet během 3 dnů) během tréninku se sacharózou, byly z experimentu vyloučeny (2 myši z 32).

Základní test (den 7): Sedmý den byly posuvné dveře v komoře CPP zataženy a myši byly ponechány prozkoumat celé zařízení po dobu 30 minut. Byl zde také přijat přístup nezaujatého aparátu/nezaujatého přiřazení, jak je popsáno v proceduře alkohol-CPP. Kondicionování sacharózou (dny 8–15): Trénink začal 24 hodin po základním testu jedním sezením denně po dobu 8 dnů s klouzavým pohybem dveře zavřené. 9., 11., 13. a 15. den byly myši umístěny do párového oddělení ao minutu později byly na podlahu rozptýleny tři pelety sacharózy.
Myši byly vráceny do svých domovských klecí o 15 minut později. V střídavých dnech (tj. 8., 10., 12. a 14. den) byly myši umístěny do nepárového kompartmentu na 15 minut bez interference.

Párové kompartmenty byly vyváženy. Test preference místa 1 (den 16): Test preference místa byl takový, jak je popsáno pro základní test, a sloužil k indexování sacharóza-CPP. Preference byla definována jako zvýšení procenta času stráveného v oddělení se sacharózou během testu preference místa 1 ve srovnání se základním testem. Získávání paměti (dny 17): Postup získávání paměti sacharózy byl identický s postupem získávání paměti alkoholem (viz výše ).

Validace oligodeoxynukleotidů (ODN).

Arc antisense ODN (AS-ODN) a kódované ODN (SCR-ODN) (Sigma-Aldrich, Rehovot, Izrael) se řídily pokyny popsanými dříve [56, 86].

Funkční validace Arc AS-ODN. Arc AS-ODN (2 nmol/µl, 0,5 µl, 0,25 µl/min) byl infundován do DH v jedné hemisféře a SCR-ODN (2 nmol/µl, { {9}},5 ul, 0,25 ul/min) bylo infundováno do druhé hemisféry (strany byly vyváženy). O dvě nebo čtyři hodiny později léčené myši zkoumaly neznámý kontext (CPP kompartment, viz popis přístroje výše) po dobu 5 minut, aby vyvolaly na novosti závislou ARC expresi. Myši byly usmrceny o hodinu později (tj. 3 nebo 5 hodin po infuzi ODN), mozková tkáň byla odebrána a hladiny proteinu ARC byly hodnoceny Western bloanalýzou (obrázek S4).

Chirurgie a intrahippokampální mikroinfuze Chirurgie a mikroinfuze byly provedeny tak, jak bylo popsáno dříve [42, 87].

Chirurgická operace. Stereotaxické operace byly prováděny v anestezii isofluranem. Myši byly umístěny do stereotaxického rámu (RWD Life Science, Shenzhen, Čína) a bilaterální vodicí kanyly (C235G-2.6, 26G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) byly namířeny na DH na následující souřadnice (−2 mm za bregma, ±1,3 mm mediolaterální, −1,45 mm ventrálně k povrchu lebky). Kanyly byly zajištěny dentálním akrylem. Do vodicích kanyl byly vloženy odpovídající fiktivní kanyly (Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) a překryty prachovými nádobkami, aby bylo místo injektoru zakryté a zbavené nečistot. Myši se nechaly zotavit 7–10 dní před tréninkem alkohol-CPP.

Intrahipokampální infuze. Aktinomycin D (4 µg/µl, 0,5 µl na stranu, 0,25 µl/min, v DMSO) [19] nebo ekvivalentní objem vehikula byl mikroinjikován do DH ihned po načtení paměti . Bylo prokázáno, že infuze aktinomycinu D do hipokampu v podobné koncentraci narušuje rekonsolidaci paměti [19]. Arc AS-ODN nebo kontrolní SCR-ODN (2nmol/µl, 0,5 µl/strana, 0,25 µl/min; v PBS) byly mikroinjikovány do DH 4 h 2 hodiny před nebo 4 hodiny po načtení paměti.

Po odstranění kanyly s prachovou nádobkou a figurínou byla po dobu 2 minut prováděna mikroinfuze u myší, které byly v bdělém stavu, pomocí injekční kanyly (33 G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) přesahující 0,5 mm za vodítko hrot kanyly. Injekční kanyly byly ponechány na místě další 2 minuty. Po infuzi byly do vodících kanyly vloženy slepé kanyly, zajištěny nádobkou na prach a zvířata se vrátila do svých domovských klecí. Lokalizace kanyly byla ověřena na 30 μm silných koronálních řezech tkáně fixované paraformaldehydem obarvené kresylovou violetí.

Analýza dat

Place preference was assessed as the percentage of time spent in the alcohol/sucrose-paired compartment, relative to the total test time. Mice that spent >75 % času v kterémkoli z kompartmentů během základního testu bylo ze studie vyloučeno (9 z 267). Stanovení CPP bylo potvrzeno porovnáním skóre CPP mezi základní hodnotou a testem CPP 1 a bylo analyzováno párovým t-testem. Vzhledem k tomu, že exprese CPP (tj. tvorba paměti) je vyžadována pro získávání paměti, byla z experimentu vyloučena data od myší, které nevykazovaly CPP (minimální 5% nárůst přednostně mezi základní hodnotou a testem 1) (48 z 258).

Alkohol-CPP po interferenci s rekonsolidací paměti byl analyzován smíšeným modelem ANOVA s faktorem léčby mezi subjekty (Aktinomycin D nebo ODN) a faktorem testu v rámci jednotlivých subjektů (CPP test 1, CPP test 2). Významné interakce byly analyzovány post hoc testem Student–Newman–Keuls. Hustoty hladin imunoreaktivního ARC proteinu Western blot byly normalizovány na hodnoty GAPDH a analyzovány jednocestnou ANOVA s mezisubjektovým faktorem léčby, následovaným Dunnettovým post hoc testem. Data exprese mRNA qRT-PCR byla normalizována na Gapdh a vyjádřena jako procento exprese kontrolní skupiny.

Data ze všech genů pro každou oblast mozku byla analyzována jednosměrnou ANOVA s mezisubjektovým faktorem léčby, následovaným Dunnettovým testem pro každý gen, pro srovnání s údaji získanými z kontrolní skupiny (bez vyhledávání). Pro RNA-sekv. shromáždili jsme tkáně od 3 zvířat pro každý replikát a připravili jsme následující počet replikátů: 3 pro dorzální hippocampus (DH) – bez vyhledávání, 2 pro DH – vyhledávání, 3 pro prefrontální kortex (PFC) – bez vyhledávání a 2 pro ( PFC)-vyhledání. Po úplné izolaci RNA pomocí Trizolu byly vytvořeny sekvenační knihovny pomocí metody, kterou jsme vyvinuli [88].

Knihovny byly podrobeny 50 bp jednokoncovému sekvenování pomocí IlluminaHiseq 2000. Po potvrzení kvality sekvenačních dat pomocí FastQC byly odečty mapovány do referenčního genomu mm9 pomocí Bowtie2 [89] a anotovány pomocí Tophat2 [90].

Čtení mapovaná na geny byla kvantifikována pomocí FeatureCounts [91]. Vyloučili jsme Rn45s, Lars2, Rn4.5s, Cdk8, Zc3h7a a themitochondriální chromozom, abychom se vyhnuli počtu nadměrně amplifikovaných genů, které by mohly zkreslit normalizaci knihovny, jak bylo popsáno dříve [92]. DESeq2 [58] byl použit k identifikaci odlišně exprimovaných genů (DEG) ve vyhledávací skupině, ve srovnání s kontrolní skupinou bez vyhledávání, s hodnotou p upravenou o hranici významnosti (p(adj) < 0,05).

DOSTUPNOST DAT Data RNA-seq jsou dostupná v NCBI Gene Expression Omnibus na adrese https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi (GSE205586) s tokenem recenzenta:knyfwwiorbutvuv.

REFERENCE

1. Collins PY, Patel V, Joestl SS, March D, Insel TR, Daar AS, et al. Velké výzvy pro globální duševní zdraví. Příroda. 2011;475:27–30.

2. Heilig M, Egli M. Farmakologická léčba závislosti na alkoholu: cílové příznaky a cílové mechanismy. Pharmacol Therap. 2006;111:855–76.

3. Sinha R. Nové poznatky o biologických faktorech predikujících zranitelnost relapsu závislosti. Curr Psychiatry Rep. 2011;13:398.

4. Litt MD, Cooney NL, Morse P. Reaktivita na stimuly související s alkoholem v laboratoři a v terénu: prediktory bažení u léčených alkoholiků. Závislost.2000;95:889–900.

5. Barak S, Liu F, Ben Hamida S, Yowell QV, Neasta J, Kharazia V, et al. Narušení vzpomínek souvisejících s alkoholem inhibicí mTORC1 zabraňuje relapsu. Nat Neurosci.2013;16:1111–7.
6. Milton AL. Pití, drogy a narušení: manipulace s pamětí pro léčbu závislosti. Curr Opin Neurobiol. 2013;23:706–12.

7. Nader K, Hardt O. Jediný standard pro paměť: případ opětovné konsolidace. NatRev Neurosci. 2009;10:224–34.

8. Dudai Y. Rekonsolidace: výhoda nového zaměření. Curr Opin Neurobiol. 2006;16:174–8.

9. Przybyslawski J, Sara SJ. Rekonsolidace paměti po její reaktivaci. Behav.Brain Res. 1997;84:241–6.

10. Nader K, Schafe GE, Le Doux JE. Strachové vzpomínky vyžadují syntézu proteinů v theamygdale, aby se po opětovném získání znovu konsolidovaly. Příroda. 2000;406:722–6.

For more information:1950477648nn@gmail.com