Adenovirus vakcína obsahující zkrácený SARS-CoV-2 Spike protein S1 podjednotka vede ke specifické imunitní odpovědi u myší

Abstract:Vývoj účinné a bezpečné vakcíny proti koronaviru 2019 (COVID-19) je s ohledem na současné podmínky zásadním přístupem ke zvládání pandemie těžkého akutního respiračního onemocnění koronaviru 2 (SARS-CoV-2). V této studii jsme vytvořili zkrácený segment optimalizovaného spike genu SARS-CoV-2 (2043 bp, označovaný S1), který byl schopen kódovat zkrácený protein S1. Protein byl testován, aby se zjistilo, zda může vyvolat účinnou imunizaci u myší proti SARS-CoV-2. Přítomnost proteinu S1 byla potvrzena imunofluorescencí a Western blotem. Adenovirová vakcína nesoucí fragment genu SI (Ad-S1) byla podávána intramuskulárně myším čtyřikrát během 4 týdnů. Humorální imunita proti proteinu SARS-CoV-2 S1 byla prokázána u všech imunizovaných myší. Sérum z imunizovaných myší prokázalo vynikající antiinfekční aktivitu in vitro. Po vakcinaci Ad-S1 byla u myší pozorována silná humorální imunitní odpověď proti SARS-CoV-2, což naznačuje, že adenovirová vakcína může pomoci při vývoji vakcín proti SARS-CoV-2 a dalším geneticky odlišným viry.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Klíčová slova: SARS-CoV-2; vakcíny; adenovirový vektor; gen SI; imunita

1. Úvod

Coronavirová nemoc 2019 (COVID-19) je často spojována se selháním více orgánů a vysokou úmrtností [1] a představuje velkou hrozbu pro veřejnou bezpečnost na celém světě. K 15. červenci 2022 pandemie COVID{5}} celosvětově přetrvává a Světové zdravotnické organizaci (WHO) bylo nahlášeno 557 917 904 potvrzených případů, včetně 6 358 899 úmrtí. Kromě toho bylo k 11. červenci 2022 podáno celkem 12 130 881 147 dávek vakcíny. Navrhování a vývoj nových vakcín proti koronaviru (nCoV) má proto velký význam a je jednou z nejvyšších globálních priorit v oblasti zdraví. Protein S je klíčovým faktorem při vstupu SARS-CoV-2 závažného akutního respiračního onemocnění koronaviru 2 (SARS-CoV-2) do hostitelských buněk [2,3]. Protein se váže na hostitelský receptor a umožňuje viru hladký vstup do hostitelské buňky [4]. N-vázané glykany vyčnívají z povrchu trimeru a značně zdobí protein S, což ovlivňuje skládání proteinu S, humorální imunitu a zpracování proteáz hostitelské buňky [5]. Protein SARS-CoV-2 S má nižší hustotu glykanu vázaného přes N než jiné proteiny S indukované lidskými patogenními koronaviry [6]. Proto může být protein S vysoce imunogenní a je hlavním cílem neutralizačních protilátek. Protein S má tři strukturní domény, mezi nimiž je doména S1 nejdůležitějším povrchovým antigenem proteinu S [4]. Vzhledem k obtížnosti produkce velkých rekombinantních proteinů (extracelulární doména proteinu S je asi 1300 aminokyselin) a riziku zesílení infekce závislé na protilátkách (ADE) je S1 (asi 700 aminokyselin) a jeho doména vázající receptor (RBD, asi 200 aminokyselin) jsou široce považovány za nejatraktivnější potenciální cíle pro vakcínu proti koronaviru [7,8]. Lidský adenovirus sérotypu 5 (HAdV-C5) je široce používán v základní virologii jako vektor pro genovou terapii a dodávání vakcín [9]. HAdV-C5 má přirozenou rozmanitost a může parazitovat na většině hostitelů, což tvoří základ pro rozvoj pokusů na zvířatech. Rekombinantní adenovirové vektory s replikovatelností a replikačními defekty konstruované z HAdV-C5 byly široce používány při dodávání vakcín a genové terapii [9,10]. V současné době byly adenoviry schváleny jako vakcíny proti akutním respiračním infekcím a bylo provedeno mnoho zkoušek takových vakcín, například proti malárii a HIV-1 [9]. V tomto článku popisujeme lidskou replikačně-deficientní adenovirovou vakcínu SARS-CoV{56}} a její přípravu a aplikaci. V této studii byla adenovirová vakcína zkonstruována následovně: vektorem byl lidský replikačně defektní adenovirus HAdV-C5 s delecí E1 a E3, kostrovým plazmidem byl rekombinantní adenovirus s pBHGlox∆E1,3Cre, sbalovací buněčnou linií byly buňky HEK293, a cílovým genem byl zkrácený gen S1 proteinu SARS-CoV-2. Exprese proteinu S1 ve vakcíně byla identifikována Western blotem a imunofluorescenčními testy. Aby se určila kvalita imunitních odpovědí vyvolaných kandidáty vakcín na bázi spiků, byla podrobně zkoumána postvakcinační protilátková odpověď. Imunitní přínos vakcíny byl hodnocen testem vazebných protilátek (enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA]) a testem neutralizačních protilátek. Naše zjištění poskytují základ pro vývoj a hodnocení vakcín a léčby COVID{73}} na bázi proteinu S1.

2. Materiály a metoda

2.1. Buňky a zvířata

V této studii byly použity buněčné linie opičích ledvin HEK293 a Vero E6. Obě buněčné linie byly pěstovány v Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM) doplněném 2% fetálním bovinním sérem (FBS) a 1% penicilinem a streptomycinem při 37 °C s 5% CO2 a nasycenou vlhkostí. Dvacet samic myší C57BL/6 (6–8 týdnů) bylo zakoupeno od Zhejiang Animal Experimental Center, provincie Zhejiang. Myši byly náhodně rozděleny do dvou skupin s 10 myší v každé skupině. Jedna skupina byla imunizována (100 ul intraperitoneální injekce) vektorem Ad5 exprimujícím spike protein SARS-CoV-2 (Ad5-S) a druhá skupina PBS (100 ul intraperitoneální injekce) jako kontrola. Celkové množství viru bylo 5 x 109 VP Všechny myši byly imunizovány intramuskulární injekcí DO/D14 [11,12]. V D14 byla odebrána periferní krev 100 ul, sérum bylo odděleno a druhá injekce byla podána dvě hodiny po odběru krve. V D28 byla odebrána krev retroorbitální punkcí a bylo odděleno sérum. Vazebné protilátky byly detekovány 3 dny po každém odběru krve, neutralizační protilátky byly detekovány 7 dnů po každém odběru krve a cytokiny byly detekovány 7 dnů po druhém odběru krve. Všechny myši byly usmrceny; všechny testy byly provedeny v přísném souladu s „Pokyny pro péči o pokusná zvířata a jejich použití v Čínské lidové republice“ a schváleny etickou radou univerzity Zhejiang Shuren.

2.2. Vakcíny

Všechny kmeny SARS-CoV-2 použité v této studii byly shromážděny od pacientů s COVID-19 se souhlasem. Státní klíčová laboratoř pro diagnostiku a léčbu infekčních nemocí vyvinula adenovirovou vakcínu (buňka Vero, kmen WuHan, číslo GISAID: EPI_ISL_415711) proti SARS-CoV-2 a poté vakcína byla vyrobena v souladu s úrovní biologické bezpečnosti (BSL). Specifikace vakcíny je 0,5 ml/dávka a obsahuje Tris, NaCl, třtinový cukr, MgCl2.6H2O, C6H9N3O2, absolutní etanol a protein SARS-CoV-2 S1.

2.3. Konstrukce rekombinantního adenoviru

Sekvence proteinu SARS-CoV-2 S1 (č. QRU91950.1) byla získána od PubMed. V souladu s genovou degenerací byla navržena optimalizovaná nukleotidová sekvence kodonu vhodná pro expresi savčích buněk na základě předpokladu, že aminokyselinová sekvence produktového proteinu kódovaného proteinem SARS-CoV-2 S1 zůstala nezměněna. Celková délka byla 2043 bp. 50 prekurzorová sekvence byla syntetizována s tkáňovým aktivátorem plasminogenu (tPA) a sekvence kódující SARS-CoV-2 S1 aminokyselinu 2–688 a prekurzorová sekvence tPA byly ligovány. Kozakova sekvence a restrikční místo Spel byly přidány před start kodon a restrikční místo Xbal bylo přidáno za terminační kodon. Nukleotidové sekvence výše uvedených genů byly syntetizovány a klonovány do pUC18 společností Sangon Biotech, aby se získal klonovaný plazmid syntetického genu. Syntetizovaná sekvence genu SI a vektor pDC316 byly štěpeny restrikčními endonukleázami Spel a Xbal. Cílový fragment a vektor byly získány z gelu a spojeny za vzniku kyvadlového plazmidu. Kyvadlový plazmid SARS-CoV-2 byl zabalen s skeletonovým plazmidem adenovirového systému AdMax pBHGloxd∆E1 a 3Cre kotransfekcí buněk HEK293. Primární roztok viru byl získán po opakovaném zmrazení-rozmrazení a centrifugaci a virus byl amplifikován a kultivován po čištění plaků.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Stanovení titru adenoviru

Buňky HEK293 v dobrém zdravotním stavu byly vybrány a resuspendovány, aby se připravila suspenze buněk 5.0 × 105 buněk/ml, která byla nasazena na 24-jamkovou destičku (1 ml/jamku ) a kultivovány při 37 ◦C v prostředí s 5 % CO2. Vzorek byl sériově zředěn desetinásobně a zředěný vzorek (0,1 ml) 10-5 až 10-8 buněk byl naočkován na 24-jamkovou destičku . Poté byly destičky vystaveny infekci při 37 ◦C s 5% CO2 po dobu 48 hodin. Následně bylo kultivační médium odstraněno, byl přidán předem vychlazený methanol (0,5 ml) a vzorky byly fixovány při -20 °C po dobu 20 minut. Po fixaci byly vzorky promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) a blokovány 1% hovězím sérovým albuminem (BSA, 0,2 ml) při 37 °C po dobu 1 hodiny. Dále byly přidány primární (Mouse Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) a sekundární (Kozí pAb k MS IgG2a(HRP), Abcam ab97245, 1:1000) protilátky a inkubovány po dobu 1 hodiny, během které PBS sloužil k praní. Po inkubaci byl přidán nově připravený pracovní roztok (0,2 ml) a inkubován po dobu 5–10 minut při teplotě místnosti. Poté byl pracovní roztok odstraněn, vzorky byly promyty PBS a znovu byl přidán PBS (1 ml). Byl vypočten průměrný počet pozitivních buněk v mikroskopickém poli (kat. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope), kde byl vybrán gradient s 5–50 pozitivními buňkami v zorném poli a pro počítání bylo náhodně vybráno alespoň pět oblastí. . Byl vypočten počet zorných polí v každé jamce 24-jamkové destičky. Poté byl vypočítán titr viru podle následujícího vzorce (1):

2.5. PCR v reálném čase

Pro detekci exprese mRNA buněk HEK293 po virové infekci jsme extrahovali intermediární RNA podle provozních pokynů TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Celková RNA byla extrahována pomocí TRIzol a zpracována s RQ1 RNázou bez DNázy I (Promega, Madison, WI, USA), aby se odstranila zbytková DNA. Komplementární DNA (cDNA) byla získána reverzní transkripcí extrahované RNA s použitím reagenční sady PrimerScript™ RT s gDNA Eraser Kit (Takara, Kusatsu, Japonsko). Fragmenty DNA byly vytvořeny se specifickými primery P1 (50 -GGTGATTCTTCTTCAGGTTGGA-30) a P2 (50 - GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30) ​​cílového genu (S1). Gen byl amplifikován s primery P3 (50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30) a P4 (50 -TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30) jako vnitřní kontrolou (GAPHD).

2.6. Western Blot

Buněčný lyzát a supernatant byly odděleny elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) a poté přeneseny na polyvinylidenfluoridové (PVDF) membrány. Bloty byly vizualizovány zobrazovacím zařízením Western blot (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Stručně, membrány byly přeneseny do TBST (50 ml Tris-HCl, pH 7,5, 8 g NaCl [0,5 ml], 0,2 g KCl, 0,5 ml Tween -20) s 5% odtučněným sušeným mlékem a třepejte na odbarvovacím šejkru při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Membrány experimentální a kontrolní skupiny byly odstraněny z uzavíracího roztoku a inkubovány s primární protilátkou: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000), kat. #40591- T62, Sino Biological, Peking, Čína)] při pokojové teplotě. Primární protilátky byly protřepány a inkubovány přes noc na odbarvovací třepačce při 4 °C. Blot byl promyt roztokem TBST a inkubován po dobu 2 hodin se sekundární protilátkou [kozí anti-králičí imunoglobulin G (IgG) H&L (HRP) (1:10 000, kat. #ab6721, Abcam, Cambridge, UK)]. Po promytí byly bloty inkubovány po dobu 1 minuty se soupravou LumiBest ECL Substrate solution kit (kat. #4AW011-100, 4A Biotech) a poté pozorovány na zobrazovači.

2.7. Imunofluorescenční test

Buňky HEK293 (3 x 106/jamka) byly nasazeny do 12-jamkových destiček. Po 48 hodinách byly buňky infikovány adenovirem obsahujícím gen SI (Ad-S1). Po 48 hodinách bylo médium odsáto a buňky byly jednou promyty PBS obsahujícím 2% BSA a fixovány po dobu 15 minut methanolem, který byl předem chlazený po dobu 15 minut při -20 °C. Po třech promytích 2% BSA v PBS byly buňky permeabilizovány 0,5% Tritonem X-100 po dobu 10 minut. Poté byly buňky blokovány po dobu 1 hodiny pomocí 2 ml 2% BSA, blokovací roztok byl odstraněn a buňky byly třikrát promyty PBS. Následně byly do každé jamky přidány 2 ml primární protilátky [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, kat. #40591-T62, Sino Biological)] a inkubovány při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny nebo 4 ◦C přes noc. Poté byl vzorek třikrát oplachován 2% BSA po dobu 5 minut na jedno oplachování. Dále byly do každé jamky přidány 2 ml sekundární protilátky [kozí anti-králičí IgG H&L (Alexa Fluor 488) (1:1000, kat. #550037, ZenBio)] a inkubovány při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Následně byly vzorky třikrát oplachovány 2% BSA po dobu 5 minut na jedno oplachování. 40,6-diamidino-2-fenylindolový (DAPI) roztok (2 ml, 1 mg/ml) (1:400, kat. č. S0001, Bioss, Woburn, MA, USA) byl přidán do každé jamky a reagovala 10 minut ve tmě. Analýza byla pozorována pomocí zobrazovacího systému EVOS™ M7000 (kat. #AMF7000, Invitrogen).

2.8. ELISA

Protein SARS-CoV-2 S (1 µg/ml) byl přes noc potažen v 96-jamkových destičkách (100 µL/jamka) 0. 05M bikarbonátový pufr. Po promytí PBST (0,2 g KH2PO4, 2,9 g Na2HPO4·12H2O, 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,5 ml Tween-20 přidejte vodu na 1000 ml) pět krát byl přidán blokovací roztok a inkubováno při 37 °C po dobu 1 hodiny. Vzorek séra byl zředěn a přidán do každé jamky (100 ul/jamku). Po 1 hodině inkubace při 37 °C byly vzorky pětkrát promyty PBST. Byla přidána primární protilátka [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, kat. #40591-T62, Sino Biological)] a inkubována po dobu 1 hodiny, poté vzorky byly pětkrát promyty PBST, následovala 1 hodina inkubace při 37 °C se sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou [kozí anti-králičí IgG H&L (HRP) (1:10 000, kat. #ab6721, abcam)] a pět promyje PBST. Po přidání 3, 30, 5 a 50-tetramethylbifenylanhydridu po dobu 5 minut byla reakce zastavena 2M kyselinou sírovou. Optická hustota byla měřena při 450 nm a 630 nm přístrojem pro značení enzymů (Molecular Devices, SpectraMax 190) a poté proložena standardní křivkou.

Výhody cistanche tubulosa- posílení imunitního systému

2.9. Stanovení cytokinů 

Destička (kat. #T-k15048D-1, MSD) byla třikrát promyta 150 ul/jamku promývacího pufru a do každé jamky bylo přidáno 50 ul připraveného vzorku. Poté byla destička uzavřena adhezivním těsněním destičky a inkubována při teplotě místnosti za třepání po dobu 2 hodin. Dále byla destička promyta třikrát 150 ul/jamku promývacího pufru a do každé jamky bylo přidáno 25 ul roztoku detekční protilátky. Destička byla znovu uzavřena a inkubována při teplotě místnosti za třepání po dobu 2 hodin. Dále byla destička třikrát promyta alespoň 150 ul/jamku promývacího pufru; Do každé jamky bylo přidáno 150 ul 2x Read Buffer T (MSD) a destička byla analyzována na MSD přístroji.

2.10. Neutralizační protilátka

2.10.1. Pseudovirus neutralizační test

Neutralizační aktivita myšího séra byla testována pomocí pseudovirového systému viru vezikulární stomatitidy (VSV). Sérum bylo inaktivováno ve vodní lázni po dobu {{0}},5 h při 56 ◦C a poté sériově naředěno na požadovaný rozsah. Buňky HEK293 byly umístěny na 96-jamkovou destičku. Zředěné sérum bylo smícháno s 200 CCID50 (dávka viru, která může infikovat 50 % buněčné kultury)/100 µl virové suspenze v poměru 1:1 a umístěno do CO2 inkubátoru (37 ± 1 ◦C). 2 h. Dále bylo do každé jamky přidáno 100 ul virového udržovacího roztoku obsahujícího 0,5% dvojitou protilátku penicilin-streptomycin a neutralizovaná směs byla naočkována do 96-jamkové destičky obsahující buňky v množství 100 ul na jamku, se dvěma opakujícími se jamkami pro každé ředění. Současně byla nastavena normální buněčná kontrola a buňky byly inkubovány v CO2 inkubátoru (37 ± 1 ◦C) po dobu 96 hodin. Poté bylo 200 CCID50/100 ul virového roztoku naředěno na 10-1~10-3. Buněčné kultivační médium v ​​96-jamkové destičce bylo odstraněno, do každé jamky bylo přidáno 150 ul roztoku pro udržení viru a roztok viru byl naočkován v koncentraci 10-1~{{33} } do jamek 96-jamkové destičky (50 µl na jamku). Každé ředění bylo opakováno v 8 jamkách; současně byla nastavena normální buněčná kontrola a poté kultivace po dobu 96 hodin. Změny v buněčném CPE byly pozorovány pod inverzním mikroskopem. Normální buněčná kontrola by neměla mít žádné cytopatické změny a pozitivní kontrola by měla mít změny CPE. Neutralizační koncové body (ředění séra převedené na logaritmy) byly vypočteny pozorováním CPE. Séronegativní/pozitivní kritérium bylo 1:12 jako pozitivní/negativní kritérium,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Živý neutralizační test

Neutralizační aktivita myšího séra byla hodnocena živým neutralizačním testem. Naředěné sérum bylo smícháno se SARS-CoV-2 a inkubováno při 37 ◦C po dobu 1 hodiny. Směs byla přidána do 96-jamkové destičky, aby se infikovaly buňky Vero E6. Po 72-h inkubaci při 37 ◦C byl pozorován cytopatický efekt viru (CPE) při 40násobném zvětšení a byl vypočten neutralizační titr (reciproční 50% ředění séra potřebné k neutralizaci virové infekce). Výše uvedené postupy byly všechny prováděny v prostředí úrovně 3 biologické bezpečnosti.

2.11. Statistická analýza

Statistické analýzy byly provedeny dvouvzorkovým t-testem pomocí SPSS 26. p-hodnoty Menší nebo rovné 0,05 byly považovány za významné. Centrální tendence byla měřena pomocí geometrického středního titru (GMT).

3. Výsledky

3.1. Konstrukce rekombinantního adenoviru

Byl získán rekombinantní adenovirový kyvadlový plazmid pAdeno-CMV-Sl se správnou inzercí; jeho strukturní diagram je znázorněn na obrázku 1. Rekombinantní adenovirus obsahoval genom HAdV-C5 postrádající oblast El/E3. Schematický diagram rekombinantního adenovirového vektoru získaného transfekcí kyvadlového plasmidu a cytoskeletového plasmidu v buňkách HEK293 je znázorněn na obrázku 1.

3.2. Charakterizace rekombinantního adenoviru

Rekombinantní plazmid obsahující cílový gen byl identifikován pomocí PCR (viz obrázek 2A pro výsledky gelové elektroforézy). Toto byl opakovaný experiment. Sekvence primerů byly MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag a S1-R acaataagtagggactgggtc a sekvenování potvrdilo, že sekvence byla v souladu s návrhem. Exprese SARS-CoV-2 S1 v buňkách byla detekována pomocí Western blottingu (obrázek 2B) a nepřímé imunofluorescence (obrázek 2C). Zbarvení pásu (~75 kDa) bylo detekováno Western blotem a bylo konzistentní s očekávanou polohou pásu. Na transkripční úrovni byla in vitro exprese S1 detekována pomocí PT-PCR. Výsledky ukázaly, že exprese mRNA S1 v buňkách HEK-293 byla významně vyšší než v kontrolní skupině.

Obrázek 1. Konstrukce rekombinantní adenovirové vakcíny a experimentální strategie. (A) pAdeno-CMV-S1 je rekombinantní adenovirový kyvadlový plazmid obsahující cílový gen S1. pBHGlox∆E1,3Cre je adenovirový skeletový plazmid. pBHGlox∆E1,3Cre a pAdeno-CMV-S1 byly extrahovány soupravou pro extrakci plazmidů QIAGEN (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Peking, Čína). Jeden den před transfekcí byly buňky HEK293 pasážovány v 25 cm2 kultivační baňce. Kultivační médium bylo DMEM obsahující 5% FBS bez antibiotik. Druhý den bylo vybráno 60–80 % buněk a k buňkám byl přidán transfekční roztok. Po 7 dnech transfekce byly buňky seškrábnuty, odstředěny, supernatant odstraněn a buňky byly resuscitovány PBS. Buňky byly opakovaně zmraženy a rozmraženy při -80 ◦C a 37 ◦C. Po centrifugaci supernatant obsahoval primární roztok viru. Rekombinantní adenovirový kmen byl purifikován, amplifikován a získán po dalším zpracování a označen jako Ad-S1. Vakcína byla injikována intramuskulárně myším pro následné studie. (B) Zobrazené časové měřítko imunizace a odběru krve.

3.3. Adenovirus Titr

V tomto experimentu bylo vypočteno průměrně šest pozitivních buněk v pěti mikroskopických polích a virus v jamce byl zředěn 108krát. Na základě vzorce popsaného v části Materiály a metody byl titr adenoviru 4,74 x 1011 jednotek tvořících plak (pfu)/ml (obrázek 2D).

3.4. Postvakcinační buněčná imunita

Během testovacího období došlo ke statisticky významným změnám v sérových cytokinech (p Menší nebo rovno 0,05), které hlavně ukázaly, že koncentrace chemoatraktantu keratinocytů/onkogenu regulovaného lidským růstem (KC/GRO) byla poklesly a koncentrace IFN-, IL-10, IL-12p70, IL-1, IL-2, IL-4, IL{{10} } a TNF- byly zvýšeny, zatímco koncentrace IL-6 se významně nezměnila (obrázek 3).

Obrázek 2. Identifikace rekombinantního proteinu HAdV-C5–SARS-CoV-2 S1 a stanovení titru adenoviru. (A) PCR detekce rekombinantního plazmidu s cílovým genem S1. (B) Western blot detekce SARS-CoV-2. Buňky HEK293 s exponenciálním růstem byly infikovány SARS-CoV-2 po dobu 48 hodin, poté byl buněčný protein extrahován a separován pomocí SDS-PAGE. Exprese SARS-CoV-2 byla potvrzena Western blotem s kozím anti-králičím IgG. (C) Imunofluorescenční mikroskopie buněk HEK-293 infikovaných Ad-S1 (zelená). Buňky byly kontrastně obarveny 40, 6-diamidino- 2-fenylindolem (DAPI), aby se obarvila jádra. Měřítko 1000 µm. (D) Pro měření byl použit plakový test. Mikrofotografie zobrazující ředění 10-5, 10-6, 10-7 a 10-8 (zleva doprava).

Obrázek 3. Ad-S1 indukované změněné plazmatické hladiny cytokinů typu 1/2, interferonů typu 1 a dalších cytokinů. Výsledky byly detekovány odběrem krve z myší 7 dní po první imunizaci. Data jsou prezentována jako box a whisker scatterplots. Každý kruh představuje jednoho jednotlivce. p-hodnoty byly vypočteny pomocí dvouvýběrového t-testu.

3.5. Detekce anti-SARS-CoV-2 S1 protilátek po imunizaci

ELISA odhalila, že protilátky specifické pro SARS-CoV{1}} byly přítomny u myší, kterým byl injikován první a druhý Ad-S1, ale ne u myší, kterým byla injekčně podána kontrolní adenovirová kapsida nebo roztok PBS (Ad/PBS) (obrázek 4A). Titry IgG 1:210 a 1:212 byly detekovány u myší očkovaných Ad-S{10}} dva týdny po první a druhé imunizaci. Titr ředění 28 dní po vakcinaci (D28, GMT 2297,4) byl 6.{17}}krát vyšší než titr v D14 (GMT 378,9).

Obrázek 4. Ad-S1 indukoval vysoké titry protilátek (A) a neutralizační aktivitu (B, C) u myší. (A) ELISA SARS-CoV-2-specifického sérového IgG z myší imunizovaných Ad-S1-. (B) Analýza pseudovirových aktivit séra z myší imunizovaných Ad-S1-. (C) Analýza neutralizačních aktivit séra z myší imunizovaných Ad-S{10}}

3.6. Neutralizační protilátkový test

Vyvolání SARS-CoV-2 buněk Vero E6 umožnilo detekci neutralizační aktivity v imunizovaném myším séru (obrázek 4B, C). Neutralizační titry D14 a D28 buněk Vero E6 imunizovaných Ad-S1- proti živému viru SARS-CoV{{10}} in vitro byly 1:24,3 a 1:26,3, v tomto pořadí. Test pseudoviru poskytl podobné výsledky jako test živého viru s neutralizačními titry až 1:28,1 a 1:29,6 v D14 a D28, v daném pořadí. Neutralizační titr pseudoviru D28 (GMT 769,0) byl 2.{29}}krát vyšší než titr D14 (GMT 283,7).

4. Diskuze

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 až<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

V této studii jsme zkonstruovali vakcínu proti rekombinantnímu adenoviru SARS-CoV-2 obsahující podjednotku SARS-CoV-2 S1 a označili jsme ji Ad-S1. Stejně jako CanSinoBIO, který byl schválen k uvedení na trh [28], jsme v této vakcíně použili HAdV-C5. Adenovirus je široce používán v rekombinantní genové terapii a jako vakcinační vektor. Míra séropozitivnosti HAdV-C5 je však u normální populace až 75–80 % [29]. To znamená, že předskladovací imunita proti vektorům HAdV-C5 významně snižuje imunitu vyvolanou vakcínou. ChAdOx1 nCoV-19 vyvinutý na Oxfordské univerzitě ve Spojeném království používá šimpanzí adenovirový vektor, který má naopak u lidí nižší míru séropozitivity, a když je pozitivní, obvykle představuje nižší titr sérových protilátek [30] . Proto mohou být prozkoumány adenovirové vektory, které se mohou vyhnout již existující imunitě, aby se zvýšila ochranná účinnost adenovirové vakcíny. V této studii byl sérový stav myší před a po imunizaci stanoven pomocí ELISA a neutralizačních testů a poskytl důkazy o humorální imunitě pro kandidáty vakcíny. Sérum produkované po intramuskulární injekci vakcíny u myší účinně chránilo buňky Vero E6 před infekcí SARS-CoV-2 in vitro (obrázek 4). Také jsme detekovali silnější imunitní odpověď a lepší ochranu u myší po druhé imunizaci (obrázek 4). Naše experimentální výsledky jsou podobné běžným experimentálním výsledkům.

Jak výzkum SARS-CoV-2 pokračuje, několik studií prokázalo, že cytokinová bouře sekundární k infekci SARS-CoV-2 může ovlivnit produkci T-buněk, takže je pro pacienty obtížné udržet si dlouhodobou imunitu vůči SARS-CoV-2 [31]. Proto je nutné určit, zda Ad-S1 může u myší indukovat imunitu zprostředkovanou T-buňkami. Naše výsledky ukázaly, že koncentrace IFN- a IL-12 se zvýšily a koncentrace IL-4 se snížily ve skupině Ad-S1, což ukazuje, že přežití a růst Th1 buněk u myší vyvolané vakcínou. Sekrece IL-12, IL-10 a TNF- Th1 buňkami se v experimentální skupině mírně zvýšila. Tyto výsledky ukázaly, že Ad-S1 u myší účinně indukoval Th1-zkreslenou odpověď T-buněk [32]. Zvýšený IL-5 ukázal, že Th2 buňky se také účastní imunitní odpovědi a produkují určité účinky. Koncentrace KC/GRO v experimentální skupině byla významně snížena ve srovnání s kontrolní skupinou PBS, což mohlo být způsobeno sníženou chemotaxí neutrofilů, která potlačovala zánětlivou odpověď a umožňovala mírnou kontrolu vedlejších účinků vakcíny. To by bylo výhodnější pro lidi s oslabenou imunitou, jako jsou starší lidé nebo pacienti podstupující chemoterapii. Li M. a kol. [29] vyvinuli adenovirovou vakcínu s použitím Ad68 jako vektoru. Výsledky ukázaly, že in vivo neutralizační aktivita SARS-CoV-2 mohla být detekována během dvou týdnů po intramuskulární imunizaci myší BALB/c a poté pokračovala ve zvyšování a titr neutralizačních protilátek (PRNT ID50) dosáhl 957,3 v 8. týdnů. Mezitím ve studii Liu J. a kol. [33] byly vyvinuty vakcíny využívající AdC6 a AdC68 jako vektory; jak vazebné, tak neutralizační protilátkové reakce po imunizaci byly generovány 14 dní po dávce, s IgG titrem 7108 (geometrický průměrný titr, GMT; AdC6) a 5489 (GMT, AdC68). Neutralizační titr 50 (NT50) pseudovirového neutralizačního testu byl 125 (GMT, AdC6) a 67 (GMT, AdC68).

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

V této studii měly myši očkované Ad-S1 titry IgG 1:1010 a 1:122 detekované pomocí ELISA dva týdny po první a druhé imunizaci, v daném pořadí. Titr ředění ad-s1 byl 378,9 (GMT) 14 dní po inokulaci a 2297,4 (GMT) 28 dní po inokulaci. V testu neutralizační protilátky vykazovaly buňky Vero E6 imunizované Ad-S1 neutralizaci 1:24,3 a 1:26,3 v D14 a D28 proti živému viru SARS-CoV-2 in vitro, v daném pořadí. Neutralizační titry pseudoviru v D14 a D28 byly 283,7 (GMT) a 769,0 (GMT), v daném pořadí. Vakcína v této studii byla tedy účinnější, pokud jde o imunitní odpověď na myším modelu.

Vzhledem k omezením experimentálních podmínek jsme neprováděli enzymovou imunosorbentní spotovou analýzu (ELISpot) imunitních buněk sleziny experimentálních myší. Experimenty ochrany před útoky SARS-CoV-2 na myších navíc nebylo možné provést kvůli omezením laboratoře fyzické ochrany. Zjistili jsme však, že vakcína má vysokou účinnost na myších modelech a může být použita jako ideální rezervní vakcinační kmen. Kromě toho by imunogenicita, bezpečnost a účinnost potenciálních kandidátů na vakcínu SARS-CoV-2 měla být zkoumána na dalších zvířecích modelech (např. králíci, primáti, mývalové, psi), protože myší modely nemusí plně duplikovat lidské imunologické funkce.

rostlina cistanche zvyšující imunitní systém

5. Závěry

Údaje získané z našich preklinických studií adenovirové vakcíny prokázaly, že vakcína má dostatečnou bezpečnost a účinnost. Může se tedy jednat o slibnou a proveditelnou profylaktickou vakcínu proti infekci SARS-CoV-2.

Reference

1. Trougakos, IP; Stamatelopoulos, K.; Terpos, E.; Tsitsilonis, OE; Aivalioti, E.; Paraskevis, D.; Kastritis, E.; Pavlakis, GN; Dimopoulos, MA Přehled životního cyklu SARS-CoV-2, patofyziologie a racionalizované léčby zaměřené na klinické komplikace COVID-19. J. Biomed. Sci. 28., 9. 2021. [CrossRef]

2. Pillay, TS Gen měsíce: 2019-nCoV/SARS-CoV-2 nový vrcholový protein koronaviru. J. Clin. Pathol. 2020, 73, 366–369. [CrossRef]

3. Sheinin, M.; Jeong, B.; Paidi, RK; Pahan, K. Regrese rakoviny plic u myší intranazálním podáním SARS-CoV-2 Spike S1. Cancers 2022, 14, 5648. [CrossRef]

4. Kadam, SB; Sukhramani, GS; Bishnoi, P.; Pable, AA; Barvkar, VT SARS-CoV-2, pandemický koronavirus: Molekulární a strukturální poznatky. J. Basic Microbiol. 2021, 61, 180–202. [CrossRef]

5. Sternberg, A.; Naujokat, C. Strukturální rysy koronavirového spike proteinu SARS-CoV-2: Cíle očkování. Life Sci. 2020, 257, 118056. [CrossRef] [PubMed]

6. Stěny, AC; Tortorici, MA; Frenz, B.; Snijder, J.; Li, W.; Rey, FA; DiMaio, F.; Bosch, BJ; Veesler, D. Glykanový štít a maskování epitopu koronavirového spike proteinu pozorované kryo-elektronovou mikroskopií. Nat. Struktura. Mol. Biol. 2016, 23, 899–905. [CrossRef] [PubMed]

7. Wang, Y.; Wang, L.; Cao, H.; Liu, C. SARS-CoV-2 S1 je lepší než RBD jako podjednotkový antigen vakcíny COVID-19. J. Med. Virol. 2021, 93, 892–898. [CrossRef]

8. Theoharides, TC; Conti, P. Buďte si vědomi spike proteinu SARS-CoV-2: Je toho víc, než se na první pohled zdá. J. Biol. Regul. Homeost. Agenti 2021, 35, 833–838. [CrossRef] [PubMed]

9. Guo, X.; Deng, Y.; Chen, H.; Lan, J.; Wang, W.; Zou, X.; Hung, T.; Lu, Z.; Tan, W. Systémová a slizniční imunita u myší vyvolaná jedinou imunizací vakcínami na bázi lidského adenoviru typu 5 nebo 41 nesoucích spike protein koronaviru respiračního syndromu na Středním východě. Imunologie 2015, 145, 476–484. [CrossRef] [PubMed]

10. Gao, J.; Mese, K.; Bunz, O.; Ehrhardt, A. Nejmodernější vektorologie lidského adenoviru pro terapeutické přístupy. FEBS Lett. 2019, 593, 3609–3622. [CrossRef]

11. Xing, K.; Tu, XY; Liu, M.; Liang, ZW; Chen, JN; Li, JJ; Jiang, LG; Xing, FQ; Jiang, Y. Účinnost a bezpečnost vakcín COVID-19: Systematický přehled. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi 2021, 23, 221–228. [CrossRef]

12. Voysey, M.; Clemens, SAC; Madhi, SA; Weckx, LY; Folegatti, PM; Aley, PK; Angus, B.; Baillie, VL; Barnabáš, SL; Bhorat, QE; a kol. Bezpečnost a účinnost vakcíny ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) proti SARS-CoV-2: Průběžná analýza čtyř randomizovaných kontrolovaných studií v Brazílii, Jižní Africe a Spojeném království. Lancet 2021, 397, 99–111. [CrossRef] [PubMed]

13. Li, C.; Guo, Y.; Fang, Z.; Zhang, H.; Zhang, Y.; Chen, K. Analýza ochranné účinnosti schválených vakcín proti COVID-19 proti různým mutantům. Přední. Immunol. 2022, 13, 804945. [CrossRef] [PubMed]

14. Tanriover, MD; Do ˘ganay, HL; Áková, M.; Güner, HR; Azap, A.; Akhan, S.; Köse, ¸S.; Erdinç, F.; Akalın, EH; Tabak, Ö.F.; a kol. Účinnost a bezpečnost inaktivované celovirionové vakcíny SARS-CoV-2 (CoronaVac): Průběžné výsledky dvojitě zaslepené, randomizované, placebem kontrolované studie fáze 3 v Turecku. Lancet 2021, 398, 213–222. [CrossRef]

15. Xia, S.; Zhang, Y.; Wang, Y.; Wang, H.; Yang, Y.; Gao, GF; Tan, W.; Wu, G.; Xu, M.; Lou, Z. Bezpečnost a imunogenicita inaktivované vakcíny SARS-CoV-2, BBIBP-CorV: Randomizovaná, dvojitě zaslepená, placebem kontrolovaná studie fáze 1/2. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 39–51. [CrossRef] [PubMed]

16. Yang, S.; Li, Y.; Dai, L.; Wang, J.; On, P.; Li, C.; Fang, X.; Wang, C.; Zhao, X.; Huang, E.; a kol. Bezpečnost a imunogenicita rekombinantní tandemově se opakující dimerní proteinové podjednotkové vakcíny na bázi RBD (ZF2001) proti COVID-19 u dospělých: Dvě randomizované, dvojitě zaslepené, placebem kontrolované studie fáze 1 a 2. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 1107–1119. [CrossRef]

17. Mallapaty, S. Indie DNA vakcína COVID je světová první – další se chystají. Příroda 2021, 597, 161–162. [CrossRef]

18. Grifoni, A.; Weiskopf, D.; Ramirez, SI; Mateus, J.; Dan, JM; Moderbacher, ČR; Rawlings, SA; Sutherland, A.; Přemkumar, L.; Jadi, RS; a kol. Cíle odpovědí T buněk na SARS-CoV-2 koronavirus u lidí s onemocněním COVID-19 a neexponovaných jedinců. Buňka 2020, 181, 1489–1501.e1415. [CrossRef]

19. Cao, Y.; Su, B.; Guo, X.; Sun, W.; Deng, Y.; Bao, L.; Zhu, Q.; Zhang, X.; Zheng, Y.; Geng, C.; a kol. Silné neutralizační protilátky proti SARS-CoV-2 identifikované pomocí vysoce výkonného jednobuněčného sekvenování B buněk rekonvalescentních pacientů. Buňka 2020, 182, 73–84.e16. [CrossRef]

20. Amanat, F.; Krammer, F. SARS-CoV-2 Vaccines: Status Report. Imunita 2020, 52, 583–589. [CrossRef]

21. Li, Y.; Bi, Y.; Xiao, H.; Yao, Y.; Liu, X.; Hu, Z.; Duan, J.; Yang, Y.; Li, Z.; Li, Y.; a kol. Nová formulace vakcíny COVID{1}} v kombinaci DNA a proteinů poskytuje plnou ochranu proti SARS-CoV-2 u makaků rhesus. Emerg. Infikují mikroby. 2021, 10, 342–355. [CrossRef]

22. Du, L.; Ahoj.; Zhou, Y.; Liu, S.; Zheng, BJ; Jiang, S. Špičkový protein SARS-CoV – cíl pro vakcínu a terapeutický vývoj. Nat. Microbiol. 2009, 7, 226–236. [CrossRef] [PubMed]

23. Yue, L.; Cao, H.; Xie, T.; Long, R.; Li, H.; Yang, T.; Yan, M.; Xie, Z. N-terminálně zkrácený nukleokapsidový protein SARS-CoV-2 jako lepší sérologický marker než celý nukleokapsidový protein při hodnocení imunogenicity inaktivovaného SARS-CoV-2. J. Med. Virol. 2021, 93, 1732–1738. [CrossRef] [PubMed]

24. Greaney, AJ; Loes, AN; Gentles, LE; Crawford, KHD; Starr, TN; Malone, KD; Chu, HY; Bloom, JD Vakcína SARS-CoV-2 mRNA-1273 vyvolává více neutralizace zaměřené na RBD, ale s širší vazbou protilátek v RBD. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Mantus, G.; Nyhoff, LE; Kauffman, RC; Edara, VV; Lai, L.; Floyd, K.; Shi, PY; Menachery, VD; Edupuganti, S.; Scherer, EM; a kol. Hodnocení buněčných a sérologických odpovědí na akutní infekci SARS-CoV-2 demonstruje funkční význam domény vázající receptor. J. Immunol. 2021, 206, 2605–2613. [CrossRef]

26. He, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Kou, Z.; Li, W.; Farzan, M.; Jiang, S. Doména vázající receptor SARS-CoV spike proteinu indukuje vysoce účinné neutralizační protilátky: Důsledky pro vývoj podjednotkové vakcíny. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 324, 773–781. [CrossRef]

27. Deng, S.; Liang, H.; Chen, P.; Li, Y.; Li, Z.; Fan, S.; Wu, K.; Li, X.; Chen, W.; Qin, Y.; a kol. Vývoj a aplikace virové vektorové vakcíny během pandemie COVID-19. Mikroorganismy 2022, 10, 1450. [CrossRef]

28. Zhu, FC; Guan, XH; Li, YH; Huang, JY; Jiang, T.; Hou, LH; Li, JX; Yang, BF; Wang, L.; Wang, WJ; a kol. Imunogenicita a bezpečnost rekombinantní adenovirové vakcíny typu -5-vektorované COVID{2}} u zdravých dospělých ve věku 18 let nebo starších: Randomizovaná, dvojitě zaslepená, placebem kontrolovaná studie fáze 2. Lancet 2020, 396, 479–488. [CrossRef]

29. Li, M.; Guo, J.; Lu, S.; Zhou, R.; Shi, H.; Shi, X.; Cheng, L.; Liang, Q.; Liu, H.; Wang, P.; a kol. Jednodávková imunizace šimpanzí vakcínou na bázi adenoviru navozuje trvalou a ochrannou imunitu proti SARS-CoV-2 infekci. Přední. Immunol. 2021, 12, 697074. [CrossRef]

30. Guo, J.; Mondal, M.; Zhou, D. Vývoj nových vakcinačních vektorů: šimpanzí adenovirové vektory. Hučení. Vakcíny Immunother. 2018, 14, 1679–1685. [CrossRef]

31. Kaneko, N.; Kuo, HH; Boucau, J.; Farmer, JR; Allard-Chamard, H.; Mahajan, VS; Piechocka-Trocha, A.; Lefteri, K.; Osborn, M.; Bals, J.; a kol. Ztráta Bcl-6-exprimování T folikulárních pomocných buněk a zárodečných center v COVID-19. Buňka 2020, 183, 143–157.e113. [CrossRef] [PubMed]

32. Lexberg, MH; Taubner, A.; Albrecht, I.; Lepenies, I.; Richter, A.; Kamradt, T.; Radbruch, A.; Chang, HD IFN- a IL-12 synergicky převádějí in vivo generované Th17 na Th1/Th17 buňky. Eur. J. Immunol. 2010, 40, 3017–3027. [CrossRef] [PubMed]

33. Liu, J.; Xu, K.; Xing, M.; Zhuo, Y.; Guo, J.; Du, M.; Wang, Q.; An, Y.; Li, J.; Gao, P.; a kol. Heterologní prime-boost imunizace šimpanzími adenovirovými vektory vyvolávají silnou a ochrannou imunitu proti infekci SARS-CoV-2. Cell Discov. 2021, 7, 123. [CrossRef] [PubMed]