Extrakt z listů Abrus Precatorius revertuje alloxanem/nikotinamidem indukovaný diabetes mellitus u potkanů prostřednictvím hormonální (inzulín, GLP-1 a glukagon) a enzymatické (-amylázy/-glukosidázy) modulace, část 1
Mar 17, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
Pozadí
Abrus precatorius se používá v lidovém léčitelství napříč afroasijskými oblastmi světa. Dřívější účinky extraktu z listů Abrus precatorius (APLE) snižující hladinu glukózy a protektivní na slinivku byly experimentálně potvrzeny u diabetických potkanů vyvolaných STZ/nikotinamidem; základní mechanismus antidiabetického účinku a pankreatické ochrany však zůstal neznámý. Objektivní. Tato studie objasnila antidiabetické mechanismy a pankreatoprotektivní účinky APLE u diabetických potkanů. Materiály a metody. APLE byl připraven extrakční metodou ethanol/Soxhlet. Celkové fenoly a flavonoidy byly kvantifikovány kalorimetricky po počátečním fytochemickém screeningu. Diabetes mellitus (DM) byl prokázán u dospělých potkanů Sprague-Dawley (o hmotnosti 120-180 g) obou pohlaví denní sekvenční injekcí nikotinamidu (48 mg/kg; ip) aAlloxan(120 mg/kg; ip) po dobu 7 dnů. S výjimkou kontrolních krys, které měly glykémii nalačno (FBG) 4,60 mmol/l, krysy se stabilní FBG (16-21 mmol/l) 7 dnípost-nikotinamid/Alloxaninjekce byli považováni za diabetiky a byli náhodně přeřazeni do jedné z následujících skupin (model, APLE (100, 200 a 400 mg/kg, v uvedeném pořadí; PO) a metformin (300 mg/kg; PO)) a léčeni denně po dobu 18 dnů . Tělesná hmotnost a FBG byly měřeny každých 72 hodin po dobu 18 dnů. V den 18 se krysy obětovaly pod hloubkouanestézie; orgány (ledviny, játra, slinivka a slezina) byly izolovány a zváženy. Krev byla odebrána pro stanovení sérového inzulínu, glukagonu a (LP-1 pomocí soupravy ELSA specifické pro potkany,' Pankreas byl zpracován, nařezán a obarven H&E pro histologické vyšetření.enzymatickébyla hodnocena aktivita alfa (a)-amylázy a -glukosidázy. Antioxidační vlastnosti a vlastnosti APLE pohlcující volné radikály byly hodnoceny pomocí standardních metod. Výsledek. APLE v závislosti na dávce snížil počáteční FBG o 68,67 procenta, 31,07 procenta a 4,39 procenta ve srovnání s modelem (4,34 procenta) a metforminem (43,63 procenta). Léčba APLE (100 mg/kg) obnovila ztrátu hmotnosti vzhledem k modelu. APLE zvýšil sérový inzulín a GLP-1, ale snížil sérový glukagon ve srovnání s modelem. APLE zvýšil jak počet, tak střední plochu průřezu (×10 stupňů um') pankreatických ostrůvků ve srovnání s modelem. APLE produkoval na koncentraci závislou inhibici -amylázy a -glukosidázy vzhledem k akarbóze. APLE v závislosti na koncentraci vychytával DPPH a radikály oxidu dusnatého (NO) a prokázal zvýšenou antioxidační kapacitu redukující železo (FRAC) ve srovnání se standardy. Závěr. Antidiabetický účinek APLE je zprostředkován modulací inzulínu a GLP-1 inverzně s glukagonem, nekompetitivní inhibicí c-amylázy a -glukosidázy, vychytáváním volných radikálů a obnovou poškozených/nekroapoptózových pankreatických buněk.
1. Úvod
Diabetes mellitus (DM) je jedním z metabolických syndromů charakterizovaných chronickou hyperglykémií kulminující z dysregulovaného metabolismu glukózy sekundárně k poruchám funkce pankreatických buněk [1]. Patologicky je DM produktem chyb v metabolismu glukózy v důsledku poruch funkce pankreatických buněk, které způsobují buď inzulinovou insuficienci (DM 1. typu) nebo inzulinovou rezistenci (DM 2. typu). Mezi běžné příznaky DM patří polyfagie, polydipsie, rozmazané vidění, chronická ztráta tělesné hmotnosti, gastroparéza a polyurie [2]. Neřešená hyperglykémie postupem času zvyšuje riziko mikrovaskulárních komplikací DM, jako je diabetická nefropatie, diabetická retinopatie a diabetická neuropatie [2]. Tyto komplikace nastávají v důsledku rozsáhlého oxidačního stresu a lipidůperoxidacekteré jsou vedlejšími produkty reakcí mezi glukózou a biologickými molekulami [3]. Rozsáhlá glykosylace biologických molekul, jako je DNA, proteiny a lipidy, vede ke vzniku nestabilních biochemických meziproduktů, které slouží jako zdroje reaktivních forem kyslíku (ROS) a dusíkatých forem (RNS). ROS a RNS jsou klíčovými hybateli oxidačních a peroxidačních reakcí. v různých buňkách a tkáních [3].
Epidemiologicky se uvádí, že DM celosvětově postihuje více než 387 milionů lidí [4]. Předpokládá se, že tento předběžný odhad vzroste do roku 2035 na 592 milionů [5]. Zpočátku se předpokládalo, že DM vzniká v dospělosti, ale nyní se ukazuje, že DM nezávisí na věku, což jasně ukazuje, jak obrovskou hrozbu představuje DM ke globálnímu zdraví.
Cistanche může zlepšit imunitu
Léčba DM (typu 1 a 2) obvykle zahrnuje použití antidiabetik, které jsou seskupeny jako neinzulinové (včetně biguanidů (např. metformin), sulfonylmočovin (např. glyburid), SGLT-2 inhibitorů (např. dapagliflozin), sekvestranty žlučových kyselin (např. kolesevelam), mimetikum amylinu (např. pramlintid), agonista dopaminu-2 (např. bromokriptin), inhibitory DPP-4 (např. sitagliptin), GLP{{5 }} terapie RA (např. exenatid), thiazolidindion (např. rosiglitazon) a inhibitory glukosidázy (např. akarbóza a voglibóza) a inzulín (např. lidský inzulín a analogy) [6]. Konvenční antidiabetická terapie se ukázala jako účinná navzdory skutečnosti, že použití některých z nich je nákladné a může být spojeno se závažnými vedlejšími účinky[7]. Náklady, vedlejší účinky a obecné přesvědčení, že konvenční léky jsou syntetické a tedy nebezpečné ve srovnání s rostlinnými léky, které jsou považovány za „přírodní“ a relativně bezpečné, přispěly k obnovenému zájmu o používání bylin a rostlinných látek. produkty pro léčbu a management lidských onemocnění včetně DM[8,9]. Toto paradigma je zcela běžné v chudších tropických zemích světa, kde se většina lidí spoléhá na bylinnou medicínu, aby uspokojila své primární potřeby zdravotní péče [8]. Také to může pravděpodobně potvrdit obvyklé tvrzení, že užívání bylin předchází moderní medicínu a že přírodní produkty nadále slouží jako šablony pro farmaceutickou syntézu nových léků[10] včetně antidiabetik. Důležité je, že tyto bylinky a bylinné terapie se používají jako doplňková terapie způsobem, který odráží systémy víry a etnobotanické dědictví většiny místních komunit napříč afroasijskými regiony světa. Například u mnoha léčivých rostlin s etnobotanickými tvrzeními pro léčbu diabetes mellitus, jako je Chrysobalanus orbicularis[11], Spondias mombin a Mangifera indica[12], Sesamum indicum [13] a Bryophyllum pinnatum [14], byly všechny prokázány -amylázy a -inhibiční účinky na glukosidázu, které jsou považovány za nezbytné pro kontrolu glykémie. Světová zdravotnická organizace (WHO) spolu s dalšími zájmovými skupinami v reakci na tento obnovený zájem o používání bylin a bylinných produktů jako doplňkové nebo alternativní terapie doporučila začlenění domorodých léčebných systémů, zejména bylinné medicíny, do zdravotnické systémy chudších zemí [15]. Toto doporučení vyvolalo potřebu ověřit zdravotní tvrzení o léčivých bylinách běžně používaných místními lidmi k léčbě lidských nemocí[16,17]. Je zajímavé, že Abrus pre-catorius běžně nazývaný „jequirity hrášek“ je léčivá bylina široce používaná v lidovém léčitelství mnoha kultur v afro-asijských oblastech světa k léčbě lidských nemocí[18-20]. Několik zpráv zdůraznilo tradiční použití listů Abrus precatorius při léčbě a léčbě diabetes mellitus[21-23]. Za zmínku stojí, že extrakty z listů Abrus precatorius prokázaly účinnost proti diabetes mellitus [1] a rakovině prsu [24], dvěma lidským chorobám, které významně přispěly ke globální zátěži chorobami [25]. Mnoho studií odůvodnilo etnofarmakologické použití a další léčivá tvrzení Abrus precatorius tím, že experimentálně prokázaly jeho biologické vlastnosti včetně vychytávání volných radikálů [26], renoprotekce [27], neuroprotekce [28], imunomodulačních[19], protizánětlivých [29], anti-lipotoxicita [30] a antiagregace krevních destiček [31], abychom zmínili jen jeden vzorek.
Dříve byly účinky APLE na snížení hladiny glukózy a na pankreatoprotektivní účinky experimentálně prokázány u potkanů s diabetem vyvolaným STZ/nikotinamidem, aby se potvrdilo jeho použití jako antidiabetické lidové medicíny místními lidmi v západní oblasti Ghany [1]. Mechanismus, který je základem účinků APLE na snížení glukózy a na ochranu slinivky břišní, však zůstal nedostatečně objasněn. V současné době jsou mechanismy, které jsou základem účinků APLE na snížení glukózy a ochranu slinivky břišní, jako je modulace inzulínu, glukagonu a GLP-1, inhibice enzymatické aktivity -amylázy a -glukosidázy, vychytávání volných radikálů a regenerace poškození pankreatických buněk a nekroapoptóza byly prokázány in vivo a in vitro.
2. Materiály a metody
2.1. Drogy a chemikálie. Alloxan monohydrát (Sigma-Aldrich Co., St.Louis, MO, USA), nikotinamid (Sigma-Aldrich Co., St.Louis, MO, USA), akarbóza (LGM Pharma, USA), metformin (Bristol laboratories Ltd.) , kyselina gallová (Merck KGaA, USA), rutin (Acros organics, USA), kyselina askorbová (Carl Roth, Německo), kvercetin (Alfa Aesar, Velká Británie), p-nitrofenyl glukopyranosid (pNPG) (BBI Biotech, Čína), Krysa Ve studii byly použity sady Insulin ELISA, Rat Glucagon-ELISA kit a Rat GLP-1 ELSA kit (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd, Čína). Všechna ostatní rozpouštědla a chemikálie použité ve studii byly analytické čistoty.
2.2. Sběr, identifikace a autentizace listů Abrus precatorius. Čerstvé listy A. precatorius byly shromážděny z nekultivované zemědělské půdy v Sefwi Asawinso'A' (Bibiani-Ahwiaso-Bekwai District, Western Region, Ghana). Listy byly identifikovány a ověřeny kvalifikovaným botanikem v herbářové jednotce, School of Biological Sciences, University of Cape Coast, kde byl uložen dokladový vzorek (CC3366), jak bylo uvedeno dříve [1].
2.3. Příprava extraktu z listů Abrus precatorius (APLE). APLE byl připraven podle předchozí metody [1]. Stručně, ve stínu vysušené listy A. precatorius byly mechanicky rozemlety na jemný prášek. Práškové listy byly před použitím skladovány ve vzduchotěsných plastových nádobách. 120g množství práškových listů bylo namočeno v 700 ml ethanolu na 48 hodin a přikryto gázou. Směs se míchá alespoň 3krát denně. Druhý den byla směs zfiltrována přes filtrační papír umístěný v Buchnerově nálevce. Filtrát byl podroben separaci pomocí rotační odparky namontované na vodní lázni. Po získání ethanolu pomocí rotační odparky byla výsledná tmavě zelená sirupovitá kapalina sušena v exsikátoru po dobu několika týdnů, přičemž zůstal tmavě zelený pevný extrakt. Extrakt byl označen a před použitím uložen v exsikátoru. APLE byl průběžně připravován, aby bylo získáno dostatečné množství pro všechny experimenty.
2.4. Fytochemický screening APLE.APLE byl testován na přítomnost fytosloučenin, jak bylo uvedeno dříve [1]. 2.5. Stanovení celkového obsahu fenolů (TPC) v APLE. Celkový obsah fenolů v APLE byl stanoven pomocí metody Folin Ciocalteuova činidla, jak bylo popsáno dříve [32] s mírnými úpravami. Zředěná koncentrace APLE (250 μl 1 mg/ml) byla smíchána se 750 μl činidla Folin Ciocalteu (1 v 10 ředěních vodou) a 750 μl 7% Na, CO. Směsi byly poté doplněny na 5 ml a inkubovány destilovanou vodou. při pokojové teplotě po dobu 2 hodin pro vyvinutí barvy. Absorbance byla poté měřena při 765 nm pomocí spektrofotometru (UV-vis, T70 PG Instruments). Po přípravě standardní křivky kyseliny gallové (0-300ug/ml) byl TPC v APLE extrapolován z kalibrační křivky kyseliny gallové a vyjádřen v ekvivalentu kyseliny gallové (GAE). Všechny experimenty byly provedeny v triplikátech.
2.6. Stanovení celkového obsahu flavonoidů (TFC) v APLE. Celkový obsah flavonoidů v APLE byl měřen dříve popsanou metodou [33] s několika modifikacemi. Stručně, 500 μl rostlinného extraktu Abrus precatorius (1 mg/ml) připraveného v 50% ethanolu bylo smícháno s 500 μL 10% chloridu hlinitého (AlCl,.6H,O) a 1500 μl 10% octanu sodného (NAC,H,O) , 3H, O). Reakční směs byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 40 minut a absorbance byla měřena při 415 nm pomocí spektrofotometru (UV-vis, T70 PG Instruments). Po přípravě standardní kalibrační křivky rutinu (0-250ug/ml) byl TFC v APLE extrapolován z kalibrační křivky rutinu a vyjádřen v ekvivalentu rutinu (RE). Všechny experimenty byly provedeny trojmo.
2.7. Etické schválení. Všechny protokoly zahrnující zvířata byly původně přezkoumány a schváleny Institucionálním kontrolním výborem pro experimentování na zvířatech Kwame Nkrumah University of Science and Technology (KNUST) (FPPS/PCOL/006/2019). Také pokusy na potkanech byly prováděny v souladu se směrnicemi Evropské unie (2010/63/EU) o používání zvířat a péči o ně při vědeckých pokusech. Utrpení zvířat a počet zvířat byly co nejvíce sníženy, aby byly splněny požadavky v doporučeních 3R (Refinement, Replacement, and Reduction) [34].
2.8. Získávání a péče o pokusná zvířata. Zdravé 7-8-týdenní dospělé krysy Sprague-Dawley obou pohlaví (o hmotnosti mezi 120 a 180 g) byly zakoupeny od Noguchi Medical Research Institute (NMRI), University of Ghana. Krysy byly později transportovány do Animal House katedry biomedicínských věd, University of Cape Coast, Cape Coast, Ghana. Potkani byli chováni v nerezových klecích (34 cm x 47 cm x 18 cm) se suchými dřevěnými hoblinami jako podestýlkou, krmeni běžným krmivem pro hlodavce (GAFCO, TEMA) a měli neomezený přístup k vodě. Krysy byly udržovány v okolních podmínkách teploty, vlhkosti a normálního cyklu tma/světlo. Tyto podmínky se však měnily, aby vyhovovaly specifickým požadavkům některých experimentů. Před použitím v experimentech bylo krysám umožněno zvyknout si na tyto okolní a laboratorní podmínky po dobu více než dvou týdnů.
2.9. Vznik alloxanem/nikotinamidem indukovaného diabetu melitus u potkanů. Experimentální diabetes mellitus byl stanoven u normoglykemických dospělých potkanů Sprague-Dawley nalačno přes noc podle dříve popsané metody [1, 35] s určitou modifikací. Ve stručnosti, krysám byl postupně injikován nikotinamid (48 mg/kg; IP) rozpuštěný v normálním fyziologickém roztoku a udržován na ledu; poté, o 15 minut později, byl Alloxan (120 mg/kg; ip) rekonstituován ve 100 mM roztoku citrátového pufru (pH 4,5), který byl podáván krysám denně po dobu 7 dnů. Následně byl krysám podáván 5% roztok glukózy (5 ml/kg; PO) denně po dobu 7 dnů. K potvrzení vzniku hyperglykémie u krys byla krev odebírána přes noc lačněným krysám 3-7 dní po alloxanu/nikotinamidu a 5% ošetření glukózou za použití metody amputace špičky ocasu. Ocasy krys byly nejprve otřeny sterilní bavlnou namočenou v 10% ethanolu. Glukóza nalačno (FBG) byla měřena pomocí glukometru URIT G26 (URIT Medical Electronic Co., Ltd.).
2.10.Experimental Design. A curative rather than prophylactic treatment approach was adopted in this study, where after the establishment of experimental diabetes mellitus in rats, diabetic rats were subjected to various treatments. Figure 1 shows an outline of experiments carried out in this study. Rats having consistent FBG(11.1 mmol/L or >250 mg/dl) po vícenásobných měřeních byly považovány za trpící diabetes mellitus (hyperglykémie)[1,35]. Potvrzení diabetici potkani byli náhodně rozděleni do pěti skupin. Kontrolní potkani nebyli vystaveni Alloxanu; místo toho jim byl podán normální fyziologický roztok. Všechny skupiny byly léčeny po dobu 18 dnů, jak je uvedeno níže:
Kontrola: normální fyziologický roztok (5 ml/krysa/den; po) plus potrava pro hlodavce plus voda
Model: nikotinamid (48 mg/kg ip) plus Alloxan (120 mg/kg;ip) plus krmivo pro hlodavce plus voda
Metformin: nikotinamid (48 mg/kg; ip) plus Alloxan (120 mg/kg; ip) plus metformin (300 mg/kg; po) plus krmivo pro hlodavce plus voda
APLE (100 mg/kg): nikotinamid (48 mg/kg; ip) plus Alloxan (120 mg/kg; ip) plus APLE (100 mg/kg; po) plus krmivo pro hlodavce plus voda
APLE (200 mg/kg): nikotinamid (48 mg/kg; ip) plus Alloxan (120 mg/kg; ip) plus APLE (200 mg/kg; po) plus krmivo pro hlodavce plus voda
APLE (400 mg/kg): nikotinamid (48 mg/kg; ip) plus Aloxan (120 mg/kg; ip) plus APLE (400 mg/kg po) plus krmivo pro hlodavce plus voda
2.11. Měření tělesné hmotnosti.Tělesná hmotnost krys byla měřena před zahájením všech pokusů na zvířatech. Následně byla každé 3 dny po dobu 18 dnů měřena tělesná hmotnost potkanů ve všech skupinách. Dávky byly upraveny tak, aby odrážely změny tělesné hmotnosti každé 3 dny. Nakonec byla změřena tělesná hmotnost krys ve všech skupinách před jejich usmrcením.
2.12. Odběr krve, příprava sér a izolace orgánů.Po zvážení krys v den 18 byly krysy usmrceny v hluboké chloroformové anestezii. Vzorky krve byly odebrány srdeční punkcí a poté rozděleny do označených prázdných zkumavek vacutainer. Reprezentativní vzorky krve pro každou skupinu byly odstřeďovány při 3000 ot./min. (centrifuga Eppendorf 5702,4 stupně) po dobu 5 minut. Pro získání séra byl supernatant odebrán do příslušně označených vzorkových zkumavek. Játra, ledviny, slezina a slinivka byly odebrány, čerstvě zváženy a fixovány v 10% formalínu.
2.13.Měření sérového inzulínu, glukagonu a GLP-1.Hladiny sérového inzulínu, glukagonu a GLP-1 byly měřeny pomocí potkaního inzulínu ELISA (Wuxi Donglin Sci &Tech Development Co. Ltd, Čína), potkaního glukagonu ELISA (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd. , Čína) a krysí GLP-1 ELISA (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd., Čína) přesně podle pokynů výrobce.
2.14. Stanovení střední plochy Langerhansových ostrůvků pankreatu.Po histologickém zpracování reprezentativního pankreatu byly výsledné mikrofotografie pro příslušné skupiny naskenovány pomocí okulárové kamery Amscope MD35, jak bylo popsáno výše[1]. Každá mikrofotografie byla nahrána do Adobe photoshop CS6 a následně umístěna na stereologickou mřížku. Byl spočítán počet průsečíků překrývajících stroma pankreatických ostrůvků. Průřezová plocha Langerhansových ostrůvků pankreatu reprezentativního pankreatu byla stanovena pomocí Cavalieriho metody a počítání bodů [36]. Plocha průřezu byla určena vzorcem:
kde
A představuje průřezovou plochu Langerhansových ostrůvků slinivky břišní
XP představuje celkový počet průsečíků překrývajících stroma pankreatických ostrůvků
a/p představuje plochu na bod stereologické mřížky M představuje lineární zvětšení.
2.15. Extrakce -amylázy z pankreatu morčat.Po 20 hodinách hladovění bylo morče usmrceno v hluboké anestezii a slinivka byla chirurgicky odstraněna. Slinivka byla zbavena tuku a jakékoli jiné tkáně a okamžitě promyta pufrem fosforečnanem sodným (pH 7,4). Po zvážení slinivky břišní byla uchovávána v mrazáku při 4 stupních. Zmrazená slinivka byla poté homogenizována (1 g slinivky: 5 ml pufru) s ledově studeným 0,1 M pufrem fosforečnanu sodného (pH 7,4) pomocí homogenizéru (homogenizátor WiseTis HG-15D) a poté odstředěna při 4400 ot./min po dobu 30 minut při 4 stupních. Supernatant byl napipetován do samostatných mikrocentrifugačních zkumavek a uložen v mrazáku při -20 stupních. Pro potvrzení extrahovaného enzymu (-amylázy) byla komerčně dostupná -amyláza testována s extrahovaným enzymem (-amyláza) za použití škrobu a jódu. Slabé nebo vymizení modročerného zbarvení považovaného za indikaci aktivity -amylázy bylo porovnáno s kontrolním uspořádáním (žádný enzym plus škrob plus jód), kde bylo tmavě modročerné zbarvení.
2.16. Účinek APLE na enzymatickou aktivitu -amylázy.Inhibice enzymatické aktivity alfa ( )-amylázy byla testována podle předchozí metody [37] s určitými modifikacemi. Stručně, APLE (125 ul) nebo akarbóza ve zvyšujících se koncentracích (100-1500 ug/ml) byly přidány do sady označených zkumavek obsahujících 125 ul roztoku -amylázy v 20 mM pufru fosforečnanu sodného (pH 6,9). Směs APLE nebo akarbóza/-amyláza byla preinkubována při 25 stupních po dobu 10 minut. Následně bylo ve zvolených časových intervalech přidáno 125 ul 1% škrobu (připraveného v 20mM fosfátovém pufru, pH=6.9). Reakční směs byla v každém případě inkubována při 25 stupních po dobu 10 minut. Ukončení každé reakce bylo provedeno v časových intervalech přidáním 250 ul 3,5-kyseliny dinitrosalicylové (DNSA) a dále zahříváno ve vodní lázni při 100 °C po dobu 5 minut, poté ponecháno vychladnout na teplotu místnosti. Každá reakce byla doplněna na 2,5 ml destilovanou vodou a absorbance byla měřena při 540 nm pomocí spektrofotometru (UV-vis, T70 PG Instruments). Kontrolní sestava byla připravena za použití stejného postupu kromě toho, že -amyláza byla preinkubována s destilovanou vodou místo APLE. Inhibiční aktivita alfa()-amylázy byla vypočtena následovně:
2.17. Způsob inhibice enzymatické aktivity -amylázy pomocí APLE.Způsob inhibice enzymatické aktivity -amylázy pomocí APLE byl proveden podle předchozí metody [38] s určitou modifikací. Stručně řečeno, 125 μl APLE（5 mg/ml） bylo nejprve preinkubováno se 125 ul roztoku -amylázy v 20mM fosfátu při 25 stupních po dobu 10 minut v sadě označených zkumavek. Poté bylo do reakčních směsí přidáno 125 ul roztoku škrobu o různých koncentracích (0,{11}} mg/ml).
spustit reakci. Reakční směs byla poté inkubována při 25 stupních po dobu 10 minut před přidáním 250 ul činidla 3,5-dinitrosalicylové kyseliny (DNSA), aby se reakce zastavila. Množství vytvořeného produktu bylo testováno měřením absorbance při vlnové délce 540 nm za použití spektrofotometru (UV-vis, T70 PG Instruments). Postup byl opakován pro kontrolu nastavenou preinkubací -amylázy s pufrem místo APLE. Lineweaver-Burk graf z grafu Michaeles-Menten byl proveden pomocí Graph-Pad prism verze 8 (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA) pro odhad Km a Vmax. Způsob inhibice enzymatické aktivity -amylázy pomocí APLE byl odvozen z odhadovaných Km a Vmax.
2.18. Extrakce -glukosidázy z tenkého střeva morčat.Extrakce -glukosidázy ze střev morčat byla provedena podle předchozí metody [39] s určitými úpravami. Stručně řečeno, morčata byla nejprve 20 hodiny vyhladověna a poté utracena v hluboké narkóze. Tenké střevo umístěné bezprostředně nad slepým střevem a bezprostředně pod dvanácterníkem bylo chirurgicky odstraněno a důkladně propláchnuto v ledově chladném 0,02 M pufru fosforečnanu sodného (pH 6,9) před ponořením do čerstvého roztoku pufru. V poměru 1 g střeva-ne:5 ml pufru bylo izolované střevo homogenizováno (homogenizátor WiseTis HG-15D, Německo) při 4400 ot./min. po dobu 10 minut s 2 minutovými přerušovanými přestávkami na ledu. Homogenát byl centrifugován (centrifúga Eppendorf 5430R) po dobu 30 minut při 4 stupních a supernatant byl opatrně sklizen. Alikvoty byly vloženy do 2ml kryozkumavek a udržovány při-20 stupni pro okamžité použití v experimentech. Pro potvrzení extrahovaného enzymu (-glukosidáza) byla komerčně dostupná -glukosidáza porovnána s extrahovaným enzymem (a-glukosidáza) inkubací 50 μl 3 mM p-nitrofenylglukopyranosidu (pNPG) s 25 μl komerčně dostupné nebo 25-glukosidázy. μl extrahovaného enzymu (a-glukosidázy) při 25 stupních. Pozorování žlutého p-nitrofenolového produktu po 5 minutách v každém případě bylo považováno za potvrzení aktivity -glukosidázy.
2.19. Účinek APLE na enzymatickou aktivitu -glukosidázy.Inhibiční účinky APLE a akarbózy (standardního inhibitoru -glukosidázy) byly hodnoceny předchozí metodou [40]s určitými úpravami. Stručně, fosfátový pufr (20 mM; pH =6 0,9) byl použit k přípravě p-nitrofenylglukopyranózy (pNPG) (substrát pro -glukosidázu). V samostatných experimentech byla a-glukosidáza (50 μl) preinkubována se zvyšujícími se koncentracemi APLE (25 μl v každém případě), akarbózy nebo pufru po dobu 10 minut v každém případě. Poté bylo 25 ul 3 mM p-nitrofenyl glukopyranosidu přidáno do předinkubované směsi buď APLE/a-glukosidáza nebo akarbóza/a-glukosidáza, aby se zahájila reakce. Reakční směs byla v každém případě inkubována při teplotě 25 stupňů po dobu 20 minut. Po 20 minutách inkubace byla reakce zastavena přidáním 0,1 M Na,CO, (1 ml). Kontrola byla připravena za použití stejného postupu kromě toho, že -glukosidáza byla preinkubována s pufrem místo APLE nebo akarbózy. Reakční produkt (žlutě zbarvený p-nitrofenol) po ukončení reakce byl měřen pomocí spektrofotometru (UV-vis, T70 PG Instruments) při 405 nm pro stanovení aktivity a-glukosidázy. Výsledky byly vyjádřeny jako procento kontroly. V každém případě byly experimenty opakovány třikrát. Procento (procenta) inhibice aktivity -glukosidázy bylo odhadnuto pomocí vzorce:
2.20. Způsob inhibice -glukosidázy pomocí APLE.Způsob inhibice enzymatické aktivity -glukosidázy pomocí APLE byl proveden podle předchozího postupu [41] s určitými modifikacemi. Stručně řečeno, v jedné sadě zkumavek bylo přesně 25 μl 5 mg/ml APLE preinkubováno s roztokem -glukosidázy（50μL） při 25 stupních po dobu 10 minuty. Ve druhé sadě zkumavek byla a-glukosidáza preinkubována s 50 ul 20mM fosfátového pufru (pH=6,9）). Poté bylo do obou sad zkumavek přidáno 25 ul p-nitrofenyl glukopyranosidu (PNP) v různých koncentracích (0, 3-3,0 mg/ml) pro zahájení reakce. Reakční směsi byly poté inkubovány při 25 stupních po dobu 20 minut, načež byl přidán Na, CO, (1000 ul) pro ukončení reakce. Množství uvolněného produktu bylo měřeno spektrofotometricky pomocí standardní křivky p-nitrofenolu a převedeno na reakční rychlosti (v). Byl vynesen dvojitý reciproční graf (1/v proti 1/S), kde S je koncentrace substrátu. Způsob inhibice aktivity -glukosidázy pomocí APLE byl stanoven analýzou grafu Line weaver-Burk.
2.21. Hodnocení 2,2-difenyl-1-Picrylhydrazy (DPPH) aktivity zachycování radikálů.Aktivita vychytávání radikálů DPPH byla provedena podle předchozí metody [42] s určitou modifikací. Stručně, 2 ml reakční směsi byly připraveny smícháním DPPH(1,0 ml 0,135mM) připraveného v methanolu a 1,{7}}ml různých koncentrací APLE (40,80,120,160 a 200 ug/ml) nebo kyseliny askorbové. Reakční směs byla intenzivně třepána a ponechána ve tmě při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Absorbance byla měřena (UV-vis, T70 PG Instruments) při 517 nm proti slepému pokusu. Všechny testy byly provedeny v triplikátech. Jako kontrola sloužilo stejné množství methanolu a roztoku DPPH. Aktivita vychytávání radikálů DPPH byla odhadnuta pomocí vzorce:
2.22. Oxid dusnatý (NO) Radical Scavenging Assay.ŽÁDNÁ aktivita APLE a standardů vychytávající radikály byla odhadnuta pomocí reakce Griess Illosvory, jak bylo popsáno dříve [43] s několika málo modifikacemi. Stručně řečeno, činidlo Griess Ilosvory využívalo 0,1 procenta (hm./obj.) naftylethylendiamindihydrochloridu namísto 5 procent 1-naftylaminu. Různé koncentrace
({{{{10}}}ug/ml) APLE a standardů (kyselina gallová a kyselina askorbová) připravené a upravené na 167 ul byly umístěny do označených zkumavek a poté bylo 667 ul Byl přidán 10mM nitroprusid sodný. Poté byl přidán pufr fosforečnanu sodného (167 ul, pH 7,4) a směs byla inkubována při teplotě 25 stupňů po dobu 150 minut. Poté bylo přidáno 2000 ul činidla kyseliny sulfanilové (0,33 procenta ve 20 procentech ledové kyseliny octové) a ponecháno stát po dobu 5 minut pro dokončení reakce diazotace. Nakonec bylo přidáno dalších 2000 ul 0,1% dihydrochloridu naftylethylendiaminu, promícháno a poté bylo ponecháno stát 30 minut při 25 stupních. Koncentrace dusitanů byla měřena (UV-vis, T70 PG Instruments) při 546 nm a byla vypočtena s kontrolním roztokem dusičnanů, který neobsahoval APPLE/nebo standardy, ale měl všechny ostatní složky reakční směsi. Pufr fosforečnanu sodného byl použit jako slepý roztok. Procento (procenta) NO zachycovací schopnosti APLE a standardů bylo vypočteno pomocí vzorce:
kde Ac je absorbance kontroly a At je absorbance testu (APLE/standard).
2.23. Zkouška FRAC (Ferric Reduction Antioxidant Capacity).FRAC byl testován podle předchozí metody [44] s několika modifikacemi. Stručně řečeno, reakce zahrnovala 250ul APLE/standardního roztoku v různé koncentraci (12,{3}}ug/ml), 625 ul pufru fosforečnanu sodného (0,2M při pH 6,6 ) a 625 ul 1% kyanidu železitého draselného, [K,Fe(CN)] do různých zkumavek. Ty byly inkubovány po dobu 20 minut při 50 stupních pro dokončení reakce. Poté bylo do zkumavek přidáno 625 ul 10% roztoku kyseliny trichloroctové (TCA). Celá směs byla centrifugována při 3000 ot./min po dobu 10 minut, poté bylo odebráno 1800 ul supernatantu a smícháno s 1800 ul destilované vody. Poté bylo přidáno 360 μl 0,1% roztoku chloridu železitého (FeCl) a důkladně promícháno. Absorbance roztoku byla měřena při 700 nm pomocí spektrofotometru (UV-vis, T70 PG Instruments) proti reakčnímu slepému pokusu. Typický slepý roztok obsahující stejnou směs roztoků bez APLE/nebo kvercetinu byl inkubován za podobných podmínek. Zvýšená absorbance reakční směsi indikuje zvýšenou redukční kapacitu. Experiment byl opakován třikrát pro každou koncentraci. FRAC byl měřen jako ekvivalent kvercetinu (QE).
2.24. Odhad IC a EC0 Za účelem stanovení IC a ECsoof APLE s ohledem na jeho antioxidační účinek, pohlcování volných radikálů a inhibiční účinek na enzymatickou aktivitu -amylázy a -glukosidázy byla testována řada zvyšujících se koncentrací APLE proti příslušným činnosti. Po převedení koncentrací na logout byla na vodorovné ose vynesena procenta maximálních aktivit (antioxidant, vychytávání volných radikálů a inhibiční účinek na enzymatickou aktivitu -amylázy a a-glukosidázy) na vertikální ose. Koncentrace APLE, která produkovala 50 procent maximálních aktivit (antioxidant,
vychytávání volných radikálů a inhibiční účinek na enzymatickou aktivitu -amylázy a a-glukosidázy) byly stanoveny graficky pomocí statistického softwaru GraphPad prism verze 8.
2.25. Statistická analýza.Získaná data byla prezentována jako průměr ± SD. Statistická analýza byla provedena pomocí Graph Pad Prism verze 8 pro Windows (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA). Průměrné srovnání mezi skupinami bylo provedeno pomocí jednosměrné analýzy rozptylu (ANOVA) následované Tukeyho vícenásobnými srovnávacími testy. P Menší nebo rovno 0,05 bylo považováno za statisticky významné ve všech analýzách.
Tento článek je převzat z Hindawi BioMed Research International Volume 2021, ID článku 9920826, 17 stránek https://doi.org/10.1155/2021/9920826