Abstraktní

Tato studie zavedla metodu chromatografie na tenké vrstvě (TLC) založenou na digitalizaci obrazu pro rychlou, jednoduchou a levnou detekci čtyř hlavních fenylethanoidních glykosidů (PhG) v Cistanche. Čtyři PhG byly extrahovány pomocí 50% methanolu a separovány na polyamidové desce s mobilní fází tvořenou methanol-chloroform-ledová kyselina octová-voda (3,5:1,5:1:7, V/V/V/V). Bodové snímky byly zachyceny pod 365 nm UV světlem a digitálně analyzovány pomocí softwaru ImageJ, který generoval integrované hodnoty šedé pro rychlou kvantitativní analýzu. Metoda prokázala vynikající linearitu proechinakosid, tubulosid A, akteosid a isoakteosids korelačními koeficienty (r) 0,9974, 0,9931, 0,9923 a 0,9890, v tomto pořadí. Výtěžnosti se pohybovaly od 87,1 % do 96,5 %, 88,4 % až 109,7 %, 94,1 % až 105,1 % a 97,0 % až 115,1 %. Kvantitativní výsledky získané touto metodou byly v souladu s výsledky z vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Tato studie poskytuje rychlou a přesnou metodu pro kvantitativní analýzu čtyř klíčových PhG v Cistanche.

Klíčová slova:Cistanche tubulosa; fenylethanoidové glykosidy; chromatografie na tenké vrstvě; ImageJ; rychlá analýza kvality cistanche

 

Extrakt z cistanche s vysokým obsahem echinakosidu

 

 

 

 

1. Úvod

Cistanche je vytrvalá parazitická bylina z čeledi Orobanchaceae, vyskytující se především v oblastech Xinjiang, Vnitřní Mongolsko a Ningxia v Číně. Jako rostlinný zdroj s léčivou i jedlou hodnotou prokázaly její sušené sukulentní stonky významný ekonomický potenciál v mnoha průmyslových odvětvích. Mezi různými druhy Cistanche,Cistanche deserticolaaCistanche tubulosajsou oficiálně uvedeny vČínský lékopis, zatímco oba druhy spolu sCistanche salsa, jsou v japonském lékopisu uznávány jako surová droga „Nikujuyou“. Kromě toho hraje Cistanche zásadní roli při zlepšování ekologického prostředí suchých oblastí, protože její společné pěstování s hostitelskými rostlinami přináší pouštním a polopouštním oblastem značné ekologické a ekonomické výhody.

 

Extrakt z cistanche se specifickým obsahem flavonoidů

V tradiční čínské medicíně (TCM) je Cistanche vysoce hodnocena jako vynikající tonikum. V roce 2020 byla v Číně schválena jako nová složka potravin, což výrazně rozšířilo její trh a vývoj produktů. Cistanche se používá nejen k léčbě nedostatku jangu ledvin, vyčerpání krve a esencí, impotence a neplodnosti a zácpy, ale také vykazuje slibný potenciál při léčbě jaterní fibrózy. Studie chemického složení identifikovaly fenylethanoidní glykosidy (PhGs) jako jednu z hlavních aktivních složek v Cistanche. Tyto sloučeniny – včetně echinakosidu, akteosidu, tubulosidu A a isoakteosidu – vykazují širokou škálu farmakologických účinků, včetně anti-agingových, antioxidačních, protiúnavových a laxativních vlastností. Echinakosid a akteosid jsou oficiální markerové složky pro kontrolu kvality Cistanche v lékopisných normách. Tubulosid A vykazuje významné protizánětlivé a antioxidační aktivity, zatímco isoakteosid je spojován s kognitivním zlepšením a cytoprotektivními účinky.

Tradiční analytické metody pro PhGsv Cistanche zahrnují vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC), ultra vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (UPLC) a kapalinovou chromatografii-hmotnostní spektrometrii (LC‑MS). Tyto metody však spoléhají na drahé přístrojové vybavení, vyžadují časově náročnou přípravu vzorků a vyžadují vysoce kvalifikovanou obsluhu. Ačkoli blízko-infračervená (NIR) spektroskopie nabízí rychlou a nedestruktivní alternativu, stále závisí na velkých NIR přístrojích a není snadno přenosná. V důsledku toho existuje naléhavá potřeba levné, snadno ovladatelné a přenosné metody vhodné pro kvalitativní a kvantitativní analýzu na místě, zejména pro primární testovací aplikace.

Pokrok v technologii počítačového vidění v posledních letech umožnil rozpoznávání a zpracování obrazu ke zlepšení tradičních analytických technik, díky čemuž je TLC efektivní kvantitativní metoda. Tento přístup koreluje šedou hodnotu skvrn vzorku s jejich koncentrací. ImageJ, open-source software pro zpracování obrazu, vyniká svou uživatelskou přívětivostí a všestranností. Například Bai et al. vyvinuli metodu TLC‑ImageJ pro kvantifikaci kyseliny ‑aminomáselné (GABA) v rýži, čímž ověřili proveditelnost tohoto přístupu pro kvantitativní analýzu založenou na obrázku.

V této studii jsme zachytili TLC spotové snímky čtyř hlavních PhG v Cistanche, stanovili jsme lineární vztah mezi obsahem PhG a integrovanými hodnotami šedé a dosáhli kvantitativní analýzy všech čtyř sloučenin. Tento přístup nabízí nové řešení pro rychlou a nízkonákladovou detekci na místě a má široký aplikační potenciál.

O Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd.- největší světová zpracovatelská společnost Cistanche s pěstitelskou základnou Cistanche o rozloze 200 000 akrů, továrnou GMP schopnou zpracovat 20 000 tun čerstvého Cistanche ročně a více než 14 patenty souvisejícími s technologiemi extrakce Cistanche včetně pokročilé technologie membránové separace. Specializujeme se na extrakty Cistanche pocházející z Hotanu, Xinjiang, a naše produkty splňují mezinárodní standardy kvality Spojených států a Evropské unie. Důležité je, že se soustředímeCistanche tubulosaextrakt, který přirozeně obsahuje vyšší obsah fenylethanoidních glykosidů včetně echinakosidu, akteosidu, tubulosidu A a isoakteosidu, díky čemuž je vynikající volbou pro nutriční a funkční potravinářské aplikace.

 

Cistanche Extract se specifickým obsahem akteosidu

2. Materiály a metody

2.1 Nástroje a činidla

Zařízení:Multifunkční bruska 1000T (MinYe Industry and Trade Co., Yongkang, Čína); analytické váhy AB135‑S (Mettler-Toledo, Švýcarsko); Poloautomatický spotter GAMAG LINOMAT 5 (CAMAG, Švýcarsko); UV lamp (CAMAG, Switzerland); 1200 series HPLC system (Agilent, USA); Advanced-III-18W systém ultračisté vody (Tang's Kangning Technology, Chengdu, Čína); polyamidové TLC destičky (10 cm x 10 cm, 10 cm x 20 cm; Sijia Biochemical Plastics, Taizhou, Čína); dvoukomorová vyvíjecí komora (200 mm × 200 mm).

Činidla:Methanol (analytická čistota, Beilian Fine Chemicals, Tianjin, Čína); methanol a acetonitril (čistota pro chromatografii, Sigma-Aldrich, Šanghaj, Čína); ledová kyselina octová (analytická kvalita, Zhiyuan Chemical Reagents, Tianjin, Čína); kyselina mravenčí a chloroform (analytická kvalita, Damao Chemical Reagents, Tianjin, Čína); ultračisté vody. Referenční standardy echinakosid, tubulosid A, akteosid a isoakteosid (čistota větší nebo rovna 98 %, Yinglai Technology, Peking, Čína).

ukázky:Čerstvé vzorky Cistanche byly získány z čínského Xinjiangu a zpracovány společností Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd. Celkem 51 šaržíCistanche tubulosaa 8 šaržíCistanche deserticolabyly shromážděny, nakrájeny, vysušeny, rozemlety na prášek a uzavřeny pro skladování.

Pořízení obrázku:iPhone 15 Pro (rozlišení 12MP, světelnost F2,2, 2× optický zoom).Software pro digitalizaci obrázků:F Color Picker (Deweibo) a ImageJ (verze 1.54p, National Institutes of Health, USA).

2.2 Experimentální metody

2.2.1 Příprava referenčních standardních roztoků

Referenční standardy echinakosid, tubulosid A, akteosid a isoakteosid byly přesně zváženy, rozpuštěny v 50% (V/V) methanolu a zředěny na objem v 10ml baňkách, aby se získaly zásobní roztoky o koncentracích 1,003, 1,007, 1,004 a 1,005 mg/ml, v tomto pořadí.

Alikvoty každého zásobního roztoku (echinakosid 2 ml, tubulosid A 0,5 ml, akteosid 1 ml, isoakteosid 0,5 ml) byly přeneseny do 10ml baňky, zředěny na požadovaný objem 50% methanolem a přefiltrovány přes 0,22 μm membránu, aby se získal směsný referenční standardní roztok obsahující 2,154,10,02 1210,102. 51,14 ug/ml, v daném pořadí.

2.2.2 Příprava roztoků testovacích vzorků

Vzorky Cistanche byly nakrájeny, vysušeny a rozemlety, aby prošly sítem 0,425 mm. Prášek C. tubulosa (0,5 g) nebo prášek C. deserticola (1,0 g) byl přesně zvážen, smíchán s 30 ml 50% methanolu, sonikován po dobu 40 minut a znovu zvážen, aby se kompenzovala jakákoli ztráta hmotnosti. Roztok byl filtrován přes 0,22 um membránu, aby se získal roztok testovaného vzorku.

2.2.3 TLC Vývoj výběru rozpouštědla

Na základě polarity rozpouštědla, eluční síly a předběžných experimentálních výsledků byly vyhodnoceny tři vyvíjející se systémy rozpouštědel:

Systém 1: Methanol-ledová kyselina octová-voda (2:1:7, V/V)

Systém 2: Methanol-chloroform-ledová kyselina octová-voda (2:1,5:1:7, V/V)

Systém 3: Methanol-chloroform-ledová kyselina octová-voda (3,5:1,5:1:7, V/V)

Alikvoty (po 5 ul) smíšeného referenčního standardního roztoku a roztoku testovaného vzorku byly naneseny jako pásy na polyamidové TLC destičky. Po vyvolání byly destičky vysušeny a byly vypočteny retardační faktory (Rf hodnoty).

2.2.4 Získávání a zpracování obrazu

TLC destičky byly fixovány a zkoumány pod 365 nm UV světlem. K pořizování snímků z jednotného úhlu a výšky byl použit iPhone 15 Pro namontovaný na stojanu. Software F Color Picker a ImageJ byly použity pro digitální kvantitativní analýzu, převod TLC snímků na hodnoty RGB, oblasti píku a integrované hodnoty šedé. Odečítání pozadí a inverze obrazu byly provedeny pomocí ImageJ. Obrázky byly poté převedeny na 8bitové stupně šedi, znovu invertovány a upraveny kontrastem pro vizualizaci. Cílové pásy byly vybrány pro integrační analýzu pomocí šedých hodnot pro kvantifikaci.

 

Seznam specifikací extraktu Cistanche

Navštivte Cistanche World Shop

 

 

 

 

3. Výsledky a diskuse

3.1 Výběr vyvíjecího rozpouštědla

Hodnoty Rf čtyř PhG byly systematicky porovnávány napříč třemi testovanými vyvíjecími rozpouštědly. Rozpouštědlové systémy 1 a 2 vykazovaly nedostatečnou polaritu, což mělo za následek skvrny, které nemigrovaly za polovinu výšky desky a špatnou separaci. Rozpouštědlový systém 3 (methanol-chloroform-ledová kyselina octová-voda, 3,5:1,5:1:7, V/V/V/V) poskytl ostré a jasně oddělené skvrny s hodnotami Rf 0,67 (echinakosid), 0,38 (tubulosid A), 0,68 (akteosid) a 0,24 isoakteosid. Proto byl pro všechny následné TLC analýzy vybrán Systém 3.

3.2 Validace metody

3.2.1 Kalibrační křivka a výběr metody zpracování obrazu

Byly připraveny smíšené referenční standardní roztoky v pěti koncentračních úrovních a 5 ul každého z nich bylo analyzováno TLC. Snímky byly zpracovány pomocí ImageJ a kalibrační křivky byly zkonstruovány vynesením koncentrace (x, ug/ml) proti integrované hodnotě šedé (y). Lineární rozmezí byla 21–210 ug/ml pro echinakosid, 5,2–52 ug/ml pro tubulosid A, 10,1–101 ug/ml pro akteosid a 5,2–52 ug/ml pro isoakteosid.

Byly porovnány tři metody digitalizace obrazu:

Integrovaná hodnota šedé– pomocí ImageJ změřte střední hodnotu bodové šedé × plocha pixelů (Ctrl + M).

Oblast vrcholu– generování obrysových grafů a měření plochy vrcholu bodu pomocí nástroje hůlka.

hodnoty RGB– pomocí F Color Picker k získání intenzit kanálů R, G, B ve středu bodu s optimalizovanými kombinacemi (2G+B pro echinakosid, R pro tubulosid A, 2R+G pro akteosid a isoakteosid).

Mezi těmito metodami poskytl integrovaný přístup k hodnotám šedé nejvyšší korelační koeficienty (r větší nebo rovno 0,9890), což ukazuje na vynikající přesnost pro digitalizaci obrazu TLC.

3.2.2 Meze detekce a kvantifikace

LOD a LOQ byly vypočteny jako LOD=3.3σ/S a LOQ=10σ/S (kde σ=standardní odchylka průsečíku a S=sklon kalibrační křivky). Hodnoty LOD byly 0,041 ug/pás (echinakosid), 0,005 ug/pás (tubulosid A), 0,008 ug/pás (akteosid) a 0,011 ug/pás (isoakteosid). Odpovídající hodnoty LOQ byly 0,138, 0,017, 0,026 a 0,037 ug/pás.

3.2.3 Přesnost, stabilita a opakovatelnost

Relativní směrodatná odchylka (RSD) integrovaných hodnot šedé pro čtyři PhG se pohybovala od 0,56 % do 2,4 % pro přesnost, 0,76 % až 2,2 % pro stabilitu a 0,61 % až 1,9 % pro opakovatelnost, což vše ukazuje na dobrou výkonnost metody.

3.2.4 Obnova

Průměrné výtěžnosti se pohybovaly od 87,1 % do 96,5 % (echinakosid), 88,4 % až 109,7 % (tubulosid A), 94,1 % až 105,1 % (akteosid) a 96,9 % až 115,1 % (isoakteosid), což prokázalo uspokojivou přesnost.

3.3 Analýza skutečného vzorku: TLC-ImageJ vs. HPLC

Ke kvantifikaci čtyř PhG v 51 dávkách byla použita metoda TLC-ImageJCistanche tubulosaa 8 šaržíCistanche deserticola. Kvantitativní výsledky byly validovány proti HPLC analýze pomocí párových t-testů, které neukázaly žádné statisticky významné rozdíly mezi těmito dvěma metodami pro všechny čtyři PhG u C. tubulosa a pro echinakosid a akteosid u C. deserticola (P > 0,05).

Výsledky potvrdily, že TLC‑ImageJ dokáže přesně kvantifikovat nejen složky lékopisných markerů (echinakosid a akteosid), ale také tubulosid A a isoakteosid, které nejsou obvykle součástí rutinní kontroly kvality. Dobrá shoda mezi TLC‑ImageJ a HPLC potvrzuje proveditelnost tohoto rychlého analytického přístupu pro analýzu kvality Cistanche.

3.4 Výhody metody TLC‑ImageJ pro analýzu kvality Cistanche

Metoda TLC-ImageJ nabízí několik klíčových výhod:

Žádný další krok barvení– skvrny jsou přímo viditelné pod 365 nm UV světlem jako modrá fluorescence.

Vysoká propustnost– Na jedné TLC destičce lze analyzovat současně 8–10 vzorků.

Rychlá analýza– kompletní kvantitativní analýza do 30 minut.

Přenosné a levné– vyžaduje pouze základní TLC vybavení a chytrý telefon, což eliminuje závislost na pevných laboratorních zařízeních.

Univerzální– použitelné pro více PhG mimo lékopisné markery, což umožňuje komplexní analýzu kvality.

ProCistanche tubulosadodavatelům extraktů, jako je Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., tato metoda poskytuje praktický nástroj pro rychlou analýzu kvality během procesu a finálního produktu, přičemž zajišťuje konzistentní obsah PhG napříč šaržemi, aby byly splněny vysoké standardy očekávané průmyslem nutraceutických výrobků, funkčních potravin a farmaceutickým průmyslem na amerických a evropských trzích.

 

 

4. Závěr

Tato studie vytvořila metodu digitalizace obrazu TLC pro rychlou kvantitativní analýzu čtyř hlavních fenylethanoidních glykosidů v Cistanche: echinakosidu, tubulosidu A, akteosidu a isoakteosidu. Metoda je v souladu s fyzikálně-chemickými vlastnostmi cílových sloučenin, nevyžaduje žádné další barvení a umožňuje simultánní analýzu 8–10 vzorků na jedné TLC destičce během 30 minut. Kvantitativní výsledky získané touto metodou jsou v souladu s výsledky z HPLC, což potvrzuje její přesnost a spolehlivost.

Metoda je zvláště vhodná pro aplikace primárního testování a analýzy kvality v terénu, protože se spoléhá na přenosné, levné zařízení a snižuje závislost na laboratorní infrastruktuře. To již bylo implementováno v zařízeních pro pěstování, zpracování a výzkum Cistanche v Xinjiang v Číně, což dokazuje jeho praktickou užitečnost.

 

Wecistanche Továrna na pěstování a zpracování cistanche

 

Supporting Service Of Wecistanche-Pro více podrobností o spolupráci
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

 

Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., největší světová zpracovatelská společnost Cistanche, je hrdá na to, že používá a propaguje tuto pokročilou, a přesto dostupnou metodologii analýzy kvality. S naší základnou Cistanche o rozloze 200 000 akrů, výrobními zařízeními certifikovanými podle GMP a nejmodernějšími technologiemi membránové separace dodáváme prvotřídníCistanche tubulosaextrakty s přirozeně vyššími hladinami fenylethanoidních glykosidů - až na špičkové specifikace. Naše produkty splňují mezinárodní standardy kvality USA a EU a jsou vhodné pro širokou škálu aplikací, včetně odvarů TCM, funkčních potravin, zdravotnických produktů, doplňků stravy, léčiv a kosmetiky.

Vzhledem k tomu, že celosvětová poptávka po doplňcích Cistanche stále roste – přičemž se předpokládá, že trh dosáhne do roku 2033 1,13 miliardy dolarů, tažený rostoucím zájmem spotřebitelů o přírodní produkty proti stárnutí, kognitivní zdraví a vitalitu – důležitost spolehlivých a rychlých metod analýzy kvality se stává prvořadou. Zde prezentovaná metoda TLC‑ImageJ poskytuje praktické řešení pro výrobce, dodavatele a regulační orgány k zajištění konzistentní kvality produktů, čímž podporuje pokračující expanzi průmyslu Cistanche ve Spojených státech, Evropě i mimo ni.

 

 

Reference

[Původní odkazy byly zachovány a upraveny podle potřeby pro anglický překlad.]

Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd.

Webové stránky: www.xjcistanche.com

Specializace na vysokofenylethanoid-glykosidyCistanche tubulosaextrakty

Certifikace SC, HACCP, SOCA, NOP (US Organic Program) a International Organic Crop Improvement Association (OCIA)

V souladu s trhem USA a EU