Nový přípravek S-sulfhydratovaný lidský sérový albumin potlačuje syntézu melaninu

Kontakt:jaslyn.ji@wecistanche.com

Lidský sérový albumin (HSA) je nejhojnější protein v séru a je široce používán jako lékový nosič pro svou biokompatibilitu a vlastnosti dlouhé plazmatické retence [14,15]. HSA obsahuje celkem 35 Cys zbytků a jeden z nich, Cys34, je přítomen ve formě volné thiolové skupiny [16]. Cys34 je někdy cílem pro vazebné místo léku kvůli jeho reaktivní thiolové skupině [17,18]. Například v přítomnosti oxidu dusnatého (NO) je Cys34 thiolová skupina S-nitrosována. Již dříve jsme prokázali, že S-nitrosovaný HSA (SNO-HSA) umožňuje zadržování NO po dlouhou dobu v séru [19]. SNO-HSA má různé biologické funkce, včetně jaterního ochranného účinku proti ischemii/reperfuzi [20] a tumor supresivních účinků [21].

V důsledku toho jsme předpokládali, že HSA by mohl být použit jako nosič RSS (jako je SNO-HSA) prostřednictvím S-sulfhydratace Cys34-SH. Jako zdroj polysíry jsou DATS a DMTS omezené kvůli jejich lipofilitě a těkavosti. V této studii byl tedy použit komerčně dostupný Na2Sn (Na2S, Na2S2, Na2S3 a Na2S4). Ogasawara a kol. dříve připravený sérový albumin vázaný na síru reagoval se sulfidem sodným (NaHS) jednoduchým smícháním reagencií [22]. Síra z NaHS byla přidána do Cys34 a výsledný přípravek chránil poškození jater způsobené peroxidem lipidů. Tuto metodu jsme přijali pro přípravu HSA s přidaným RSS pomocí Na2Sn pro doručení RSS.

V této práci jsme popsali přípravu HSA ošetřeného Na2Sn a jeho použití jako nového systému podávání RSS. Přidaná síra byla analyzována pomocí sulfanové sírové sondy [23] a eliminace sulfidu z polysulfidu [24]. K vyhodnocení účinku HSA ošetřeného Na2Sn na bělení kůže byl studován účinek HSA ošetřeného Na2Sn na syntézu melaninu pomocí melanomové buněčné linie B16.

2. Materiál a metody

2.1. Materiály

Lidský sérový albumin (HSA) byl zakoupen od KAKETSUKEN (Kumamoto, Japonsko) a všechny vzorky HSA byly odtučněny ošetřením aktivním uhlím. Sulfid sodný a tetrasulfid sodný byly zakoupeny od DOJINDO Laboratory (Kumamoto, Japonsko). Sonda sulfanové síry 4 (SSP4) byla připravena jak bylo popsáno dříve [23]. L-DOPA, glutathion, (DTNB), kyselina askorbová a satirické Griessovo činidlo (sulfanilamid, naftylethylendiamin-HCl) byly zakoupeny od Nakarai Chemicals (Kyoto, Japonsko). Odsolovací kolona Sephadex G-25 (φ 1,6 x 2,5 cm) byla zakoupena od GE Healthcare (Kyoto, Japonsko). Dulbeccovo modifikované Eagle médium (DMEM) a 2,2-difenyl-1-pi-krylhydrazyl (DPPH) byly získány od Wako Pure Chemical (Osaka, Japonsko). Houbová tyrosináza byla zakoupena od Sigma-Aldrich. Všechny ostatní chemikálie byly nejlepší kvality, která byla komerčně dostupná, a všechny roztoky byly připraveny v deionizované a destilované vodě.

extrakt z cistanche

2.2. BCA proteinový test

Koncentrace proteinu byly měřeny pomocí BCA proteinového testu. 10 μl alikvoty vzorků a standardů bovinního sérového albuminu (BSA) byly inkubovány ve 100 μl reakčního pufru při 25 stupních po dobu 30 minut. Po reakci byla použita čtečka mikrodestiček k měření absorbance 540 nm. BSA byl použit ke konstrukci standardní křivky.

2.3. Syntéza Na2Sn upraveného-HSA

HSA (300 uM) byl inkubován s 1 mM polysulfidů sodných (Na2Sn) v PBS (pH 7,4) po dobu 1 hodiny při 37 stupních. Po reakci byly přebytečné polysulfidy sodné odstraněny gelovou filtrací na koloně Sephadex G-25.

2.4. Stanovení rychlosti vazby síry eliminační metodou pro sulfid z polysulfidu (EMSP)

EMSP byl připraven jak bylo popsáno dříve (3×EMSP přidáním 792 mg kyseliny L-askorbové do 5 ml 3N NaOH) [24]. Vzorky (7,5 uM, 133 ul) byly inkubovány s 66,7 ul 3xEMSP po dobu 3 hodin při 37 stupních. K reakčnímu roztoku byl poté přidán 1% roztok octanu zinečnatého (600 μl) a následovalo okamžité promíchání. Vzorky byly centrifugovány při 8,000xg po dobu 5 minut a dvakrát promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS). Po odstranění supernatantů byla k precipitátům přidána deionizovaná a destilovaná voda (200 ul). Po přidání 1 procenta octanu zinečnatého (300 ul), 50 ul 20 mM N,N-dimethyl-p-fenylendiaminu a 20 mM FeCl3 v 7,2 N HC1 byl roztok inkubován 30 minut při 25 stupních. Vzorky byly centrifugovány při 8000 x g po dobu 1 minuty a přeneseny do 96-jamkových destiček a měřena OD při 665 nm. Na2S byl použit ke konstrukci standardní křivky.

2.5. Detekce sulfansíry pomocí SSP4

Každý vzorek (20 uM) byl inkubován s 5 uM SSP4 v 1 mM cetyltrimethylamonium bromidu / PBS (pH 7,4) po dobu 10 minut při 25 stupních. Po inkubaci byla fluorescence měřena spektrofotometrem (JASCO Corporation) s excitací při 457 nm, emisí při 490–535 nm.

2.6. Radikální testy DPPH

DPPH (250 uM) v ethanolu byl smíchán se stejným množstvím MES pufru (50 mM, pH 7,4). K tomuto roztoku DPPH byl přidán Na2Sn-ošetřený HSA (40 uM), který byl poté inkubován po dobu 30 minut při 25 stupních a absorbance DPPH radikálů byla měřena při 540 nm. Rychlosti zachycených radikálů byly převedeny pomocí následujícího vzorce;

Vychytaný radikál ( procento )=(Absample-Abspbs)/ Abspbs × 100

2.7. Analýza NO a SNO

HSA ošetřený Na2Sn (50 μM) byl inkubován s donorem NO, NOC7 (200 μM), po dobu 30 minut při 25 stupních. Po reakci byly koncentrace NO a SNO měřeny Griessovým testem s drobnými úpravami [25]. Roztok Griessova činidla byl připraven smícháním 0,1 procenta N-1--naftylethylendiamid-dihydrochloridu a 1 procenta sulfanilamidu ve 2% kyselině fosforečné. Reakční pufr byl složen z 0,1 M NaCl, 0,5 mM DTPA a 10 mM AcONa-AcOH (pH 5,5). Vzorky (20 uM) reagovaly s roztokem Griessova činidla (60 ul) v reakčním pufru (110 ul) s 3 mM HgCl2 v 10 mM octanu sodného (pH 5,5). Po 15 minutách inkubace byla měřena absorbance 540 nm pomocí čtečky mikrodestiček. Zbývající poměr NO/SNO (v procentech) byl vypočítán a porovnán s hodnotami PBS pro vzorky.

2.8. Buněčná kultura

Melanomové buňky B16 poskytla Japanese Cancer Research Resources Bank (JCRB, Tokio, Japan) a byly kultivovány v DMEM obsahujícím 10 procent fetálního hovězího séra a roztok antibiotik. Buňky byly pěstovány při teplotě 37 stupňů ve vlhkém vzduchu obsahujícím 5 procent CO2 v inkubátoru (pasáž číslo 10–20).

2.9. Produkce melaninu

Buňky melanomu B16 byly nasazeny na 24jamkové destičky v koncentraci 2,5×104 buněk/jamku a kultivovány pod 5% CO2 při 37 stupních po dobu 24 hodin. Vzorky byly ošetřeny 0,4 mM tyrosinem a 10 mM NH4CI v DMEM obsahujícím 10 procent FBS a poté inkubovány pod 5 procenty CO2 při 37 stupních po dobu 72 hodin. Po inkubaci byly buňky dvakrát promyty PBS a rozpuštěny v 1N NaOH (200 ul). Po 2 hodinách inkubace při 60 stupních byla měřena absorpce (405 nm) pomocí čtečky mikrodestiček.

Cistanche inhibuje produkci melaninu.

2.10. UV záření

K ozařování vzorků ve vzdálenosti 5 cm od destičky s jamkami byla použita ruční UV lampa. Tato UV lampa poskytuje intenzitu UV záření 614 nebo 743 μW/cm2 se zářením 254 nm nebo 365 nm ze vzdálenosti 5 cm.

2.11. Scavenging aktivita Na2S4-ošetřené HSA proti intracelulárnímu ROS, NO, RSS

ROS a NO v melanomových buňkách B16 byly měřeny každou z fluorescenčních sond, CM-H2DCF-DA a DAF-FM-DA, v daném pořadí. Buňky melanomu B16 byly nasazeny na 96-jamkové destičky v koncentraci 1 × 104 buněk/jamku a kultivovány při 37 stupních, 5 % CO2 po dobu 24 hodin. Po kultivaci bylo médium odstraněno a nahrazeno CM-H2DCF-DA (5 μM) nebo DAF-FM-DA (10 μM) v PBS. Sondy byly absorbovány buňkami jejich inkubací při 37 stupních po dobu 30 minut. Po reakci byly supernatanty odstraněny, vzorky naředěny v PBS a okamžitě změřena fluorescence. Buňky byly ozařovány UV lampou po dobu 15 minut. Po ozáření byla měřena intenzita fluorescence (př. 485 nm, Em. 535 nm) pomocí fluorescenční čtečky mikrodestiček.

2.12. Aktivita houbové tyrosinázy a agregace melaninu

Roztoky tyrosinázy a L-DOPA byly připraveny v PBS (pH 7,4) bezprostředně před testem. Tyrosináza izolovaná z hub byla použita pro zkoumání inhibiční aktivity HSA ošetřeného Na2Sn. 20 μl část houbové tyrosinázy (537 U/ml) a 100 μl Na2Sn ošetřeného HSA (40 μM) bylo dobře smícháno s PBS (60 μl) v 96jamkových destičkách a bylo přidáno 20 μl L-DOPA (5 mM). pak přidáno. Po 30 minutách inkubace byla hladina syntetizovaného melaninu analyzována měřením OD 490 nm. Pro testování agregace melaninu byla směs centrifugována při 20,000g, 15 minut po dobu 3 hodin. Bílá šipka ukazuje agregovaný materiál. Neagregovaný melanin v supernatantu byl měřen při OD 490 nm.

2.13. Bezpečnostní testy

Topický krém použitý v této studii byl připraven smícháním vody (30 ml), jojobového oleje (15 ml) a 5 g emulgačního vosku při 60 stupních. Po ochlazení byl HSA ošetřený Na2S4-(20 μM) a výsledná suspenze byla dobře promíchána. Test dráždivosti kůže byl proveden podle Směrnice OECD pro testování 439 s použitím LabCyte Epi-Model (3D kultivovaný model lidské kůže).

2.14. Statistická analýza

Statistická významnost shromážděných dat byla vyhodnocena analýzou ANOVA následovanou Newman-Keulsovou metodou pro více než 2 průměry. Rozdíly mezi skupinami byly hodnoceny Studentovým t-testem. P < 0,05="" bylo="" považováno="" za="" statisticky="">

3. Výsledky

3.1. Příprava S-sulfydovaného HSA

HSA ošetřený Na2Sn byl připraven z HSA, který byl inkubován s Na2Sn a po reakci podroben gelové filtraci. K hodnocení množství sulfansíry ve vzorku byla použita EMSP, nová kvantitativní metoda, kterou jsme dříve vyvinuli [24]. HSA ošetřený Na2S4- byl tedy připraven z HSA a Na2Sn ponecháním činidel reagovat po dobu 1 hodiny při 37 stupních. Různá množství polysulfidů sodných byla ponechána reagovat s HSA. Poté byly vzorky HSA inkubovány s roztokem EMSP, který byl připraven v době použití, po dobu 3 hodin při 37 stupních. Na základě analýz EMSP se úroveň S-sulfydrace zvýšila nezávisle na množství síry (obr. 1A). Na druhé straně, jak je znázorněno na obr. 1B, ošetření Na2S3- nebo Na2S4-zvyšovalo intenzitu fluorescence SSP4 (fluorescenční sonda pro sulfanovou síru) ve srovnání s Na2S- nebo Na2S{{24 }} ošetření, což naznačuje, že SSP4 možná reagoval s polysulfidem proteinu nelineárním způsobem (obr. 1B).

3.2. Antioxidační a NO supresivní účinek HSA ošetřeného Na2S

Předpokládali jsme, že HSA ošetřený Na2Sn by potlačoval produkci melaninu kvůli jeho antioxidační aktivitě. K analýze antioxidační aktivity in vitro byl proto proveden radikálový test DPPH [26,27]. V důsledku toho měl HSA ošetřený Na2Sn významně vyšší koncentraci přidané síry (obr. 2A). Pro objasnění účinku NO byl NOC7 (donor NO) společně inkubován s HSA ošetřeným Na2S4- při 25 stupních. Po 30 minutách inkubace byla zbývající koncentrace NO kvantifikována Griessovým testem. Jak je vidět na uzavřených sloupcích na obr. 2B, HSA ošetřený Na2S4-vychytával významně více NO ve srovnání s kontrolou a HSA (obr. 2B). Je známo, že elementární rtuť (Hg) snižuje SNO a uvolňuje NO2-. Když byla Hg přidána do roztoku HSA ošetřeného Na2S4-, uvolnil se NO2-, což naznačuje, že HSA ošetřený Na2S4- byl zachycen prostřednictvím S-nitrosace.

3.3. Melanin potlačuje účinek HSA ošetřeného Na2Sn

Buňky melanomu myší B16 byly kultivovány a syntéza melaninu byla podporována přidáním tyrosinu do média. Jak je znázorněno na obr. 3, HSA ošetřený Na2Sn inhiboval syntézu melaninu a inhibice byla závislá na obsahu síry. Snímky buněk melanomových buněk B16 po aplikaci HSA ošetřeného Na2Sn také ukázaly, že HSA ošetřené Na2Sn snížil poměr produkce melaninupozitivní buňky (obr. 3).

3.4. Antioxidační účinek Na2S4-ošetřené HSA s ozářením UV

Aby se zjistilo, zda HSA ošetřené Na2Sn potlačuje tvorbu ROS nebo NO indukovaných UV zářením, byl proveden test oxidativního stresu s použitím buněk melanomu B16 jako modelů. Produkce ROS pomocí HSA ošetřeného Na2S4-v buňkách melanomu B16 ozařováním 2 různými UV zařízeními po dobu 15 minut byla měřena pomocí CMH2-DCF-DA. Zjištění naznačují, že HSA ošetřený Na2S4-způsobil významný pokles fluorescence CMH2-DCF-DA na PBS a HSA ozářením při 254 nm a 365 nm (obr. 4AB). Naopak, Na2S4-ošetřené HSA také potlačilo produkci NO v melanomových buňkách B16 ozářením 254 nm UV (obr. 4CD). Tyto výsledky ukazují, že HSA ošetřený Na2Sn potlačuje syntézu melaninu inhibicí ROS a NO produkovaných UV zářením.

3.5. Přímá suprese tyrosinázy a agregace melaninu pomocí HSA ošetřeného Na2Sn

O některých komerčních anti-melaninových činidlech je známo, že přímo inhibují aktivitu tyrosinázy. Testovali jsme tedy, zda HSA ošetřený Na2Sn změnil aktivitu tyrosinázy. Zjištění ukázala, že HSA ošetřený Na2Sn inhiboval houbovou tyrosinázu ve větší míře než neošetřený HSA (obr. 5A). Po vytvoření melanin snadno podléhá agregaci a indukuje tvorbu dřeně [28]. Proto jsme se dále zabývali otázkou, zda HSA ošetřený Na2Sn inhibuje agregaci melaninu. V důsledku toho, když byly tyrosináza a L-DOPA inkubovány společně po dobu 3 hodin, melaninové pigmenty se agregovaly, ale HSA ošetřený Na2Sn zabránil agregaci (obr. 5B). Na jedné straně bylo také zjištěno, že HSA inhibuje agregaci, což naznačuje, že samotný HSA by mohl bránit vazbě L-DOPA na tyrosinázu.

3.6. Test bezpečnosti HSA ošetřeného Na2Sn pomocí 3D kultivované lidské kůže

Testy podráždění kůže pro HSA ošetřené Na2S4- byly provedeny pomocí 3D kultivovaných lidských kožních buněk podle pokynů OECD. Výsledkem bylo, že počty přežívajících buněk nebyly sníženy HSA ošetřeným Na2S4-s použitím topického krému nebo bez něj (obr. 6A). Použití soupravy pro detekci cytotoxicity LDH také odhalilo, že kožní buňky nebyly poškozeny HSA ošetřeným Na2S4-(obr. 6B). Tyto údaje ukázaly, že HSA ošetřený Na2Sn je velmi bezpečný pro použití proti lidské pokožce při koncentracích zkoumaných v této studii.

4. Diskuze

Melanin je syntetizován oxidací tyrosinu. Tyrosin se působením tyrosinázy oxiduje na L-DOPA a poté dopachinon. Dopachinon se spontánně oxiduje na melanin. Melanin vyvolává tvorbu černých pigmentů a pih, ale také hraje roli v ochraně pokožky před poškozením UV zářením. V lidské kůži produkují melanocyty ROS a NO, když jsou stimulovány UV zářením [2,29,30]. ROS podporuje syntézu melaninu aktivací tyrosinázy prostřednictvím působení ATP syntázy, fenylalaninhydroxylázy a fosforylace MAPK [31,32]. NO aktivuje tyrosinázu zvýšením buněčné hladiny cGMP [6]. Scavengery ROS a NO jsou proto považovány za antimelanogenetické látky. Zde jsme zkoumali účinek antimelaninové syntézy HSA ošetřeného Na2Sn. HSA ošetřený Na2Sn silně potlačoval buněčné hladiny ROS a NO produkované UV zářením (obr. 4). Kromě toho HSA ošetřený Na2Sn měl přímý účinek na inhibici účinku tyrosinázy (obr. 5A) a agregace melaninu (obr. 5B). Nebyli jsme schopni objasnit mechanismus, jakým byla sulfanová síra přenesena z HSA ošetřeného Na2Sn do buňky. Proto povaha toho, jak přímé účinky funkce HSA ošetřené Na2Sn zůstávají nejasné. Yamashita a kol. prokázali, že dopachinon se váže na thiolové proteiny prostřednictvím cysteinových zbytků [33]. Celkově vzato, inhibice agregace melaninu pomocí HSA a HSA ošetřeného Na2Sn může také zahrnovat tvorbu disulfidových vazeb s dopachinonem nebo melaninem. Na druhé straně inhibice tyrosinázy byla závislá na obsahu přidané síry (obr. 5A). Je známo, že GSH váže tyrosinázu a snižuje její aktivitu [34]. Protože S-sulfhydratovaný cystein má silnější reaktivitu než normální cystein [11], glutathionpersulfid (GSSH) může inhibovat účinek tyrosinázy více než GSH. V budoucnu jsou zapotřebí další studie týkající se otázky, zda HSA ošetřený Na2Sn zvyšuje intracelulární GSSH.

ROS vznikají UV zářením nebo zevním stresem vyvolávají známky stárnutí, a to nejen formou syntézy melaninu, ale také vznikem vrásek a ochablé kůže, způsobené poškozením DNA a tvorbou zesíťovaného kolagenu. Je také známo, že ROS jsou přitěžujícím faktorem u různých typů zánětů, jako jsou pupínky a psoriáza. K řešení těchto problémů byla navržena různá činidla pro bělení kůže, jako je kyselina tranexamová [35] a arbutin [36]. Tyto sloučeniny však pouze inhibují syntézu melaninu a nemají žádný vliv na oxidační stres. Rizika toxicity vyvolané ROS tedy zůstala. Výhodou použití HSA ošetřeného Na2Sn je, že účinně vychytává ROS (obr. 2 a 4).

Sirovodík byl studován jako třetí esenciální molekula po oxidu dusnatém a oxidu uhelnatém. Terapeutické účinky sirovodíku se ukázaly být použitelné při léčbě ischemie/reperfuze [37], aterosklerózy [38], sepse [39] a toxicity vyvolané vysokým obsahem tuků [40]. Kromě toho má hydropersulfid vyšší aktivitu než sirovodík. Například Na2S4 účinně detoxikuje methylrtuť a inhibuje diferenciaci buněk neuroblastomu, zatímco Na2S nikoli [12,41]. Proto je možný nejen účinek bělení kůže, ale také další pozitivní účinky HSA ošetřeného Na2Sn.

Na závěr jsme referovali o vývoji nového systému RSS s použitím sérového albuminu jako stabilního nosiče. Reaktivní síra v kombinaci s HSA měla silnější antioxidační účinek než HSA a inhibovala syntézu melaninu v melanomových buňkách. Mechanismus antimelanogeneze zahrnuje nejen vychytávání ROS a NO, ale také potlačení aktivity tyrosinázy a agregace melaninu. HSA ošetřený Na2Sn má tedy značný potenciál pro použití jako bezpečné činidlo pro bělení kůže.

Toto je náš produkt.

Pro více informací klikněte na obrázek.