Nový Netrin-1-odvozený peptid zvyšuje ochranu před neuronální smrtí a zmírňuje intracerebrální krvácení u myší, část 1

Abstraktní:

Bylo hlášeno, že Netrin-1 se podílí na neuroprotekci po poranění centrálního nervového systému. Minimální funkční doména Netrin-1, která může zachovat neuroprotekci, ale vyhnout se hlavním vedlejším účinkům Netrinu, však zůstává nepolapitelná.

Centrální nervový systém je jedním z nejdůležitějších nervových systémů v lidském těle, který řídí myšlení, pocity a jednání lidí. Při poškození centrálního nervového systému bude ovlivněna i paměť lidí. Ale nebojte se, můžeme přijmout několik pozitivních způsobů, jak pomoci obnovit paměť.

Nejprve musíte pochopit dopad poškození paměti. Poškození centrálního nervového systému může ovlivnit kognitivní schopnosti lidí, procesy myšlení a pozornost, to vše přímo ovlivňuje lidskou paměť. Kromě toho může poškození centrálního nervového systému také způsobit emoční nestabilitu, díky čemuž jsou lidé náchylnější k panice, úzkosti a depresím, a tím ovlivnit obnovu paměti.

Nicméně i když poškození centrálního nervového systému může přinést některé negativní účinky, můžeme přijmout některá pozitivní opatření na podporu obnovy paměti. Nejprve si můžeme vyzkoušet nějaký kognitivní trénink, jako je čtení, psaní a řešení hádanek. Tyto aktivity mohou stimulovat mozek, aby produkoval nové neurony a pomáhat mozku budovat nové vzpomínky a způsoby myšlení.

Za druhé, můžeme také podpořit obnovu paměti pomocí nějakého fyzického cvičení. Studie prokázaly, že správné cvičení může stimulovat mozek k produkci nových neuronů a neuronových spojení a podporovat mozkové zpracování nových informací. Někteří lidé proto najednou při běhu nebo chůzi přijdou s dobrým nápadem nebo vyřeší složitý problém.

Nakonec musíme věnovat pozornost roli správného nutričního příjmu na paměť. Normální fungování mozku vyžaduje některé nezbytné živiny, jako jsou bílkoviny, vitamíny a stopové prvky. Pokud naše jídlo tyto živiny postrádá, ovlivní to naši paměť a schopnost myšlení. Proto bychom si ve stravě měli vybrat některé potraviny bohaté na tyto živiny, jako jsou ryby, libové maso, zelenina a ovoce.

Stručně řečeno, poškození centrálního nervového systému bude mít určitý dopad na paměť lidí, ale můžeme podpořit obnovu paměti správným kognitivním tréninkem, fyzickým cvičením a kontrolou stravy. Doufám, že každý dokáže čelit výzvám v životě pozitivně, zachovat si optimistický přístup a snažit se obnovit zdravý centrální nervový systém a dobrou paměť. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche je tradiční čínská medicína s mnoha unikátními účinky, z nichž jedním je zlepšení paměti. Účinnost Cistanche pochází z různých účinných látek, které obsahuje, včetně kyseliny tříslové, polysacharidů, flavonoidních glykosidů atd., které mohou mnoha způsoby podporovat zdraví mozku.

Kliknutím na možnost Know zlepšíte krátkodobou paměť

Zde jsme zkoumali neuroprotektivní účinek peptidu E1 odvozeného z Netrin-10s EGF3 domény (zbytky 407–422). Zjistili jsme, že interaguje s deletovaným kolorektálním karcinomem (DCC) za účelem aktivace fosforylace fokální adhezní kinázy vykazující neuroprotekci.

Podávání peptidu E1 bylo schopno zlepšit funkční zotavení prostřednictvím snížené apoptózy v experimentálním myším modelu intracerebrální hemoragie (ICH).

V souhrnu odhalujeme funkční sekvenci Netrinu-1, která se účastní procesu obnovy po ICH, a identifikujeme kandidátní peptid pro léčbu ICH.

Klíčová slova: intracerebrální krvácení; hemin; neuroprotekce; Netrin{0}}; peptid.

1. Úvod

Intracerebrální krvácení (ICH) je devastující podtyp cévní mozkové příhody s vysokou mortalitou a morbiditou [1–3], který zahrnuje abnormální ruptury mozkových krevních cév v mozku [4,5].

Chirurgické odstranění hematomů je preferováno pro dosažení hemostázy a zmírnění intrakraniálního tlaku [6]. Zbytková hematická rezidua a produkty rozpadu krve však mohou stále podporovat sekundární poškození mozku po ICH, indukovat poškození neuronů a zpomalovat funkční zotavení [7–9].

Vývoj účinných strategií zaměřených na sekundární poškození neuronů způsobené sekundárním poškozením mozku by tedy byl prospěšný pro léčbu mrtvice. Netrin-1 je jedním z nejlépe prostudovaných proteinů, které regulují axonální vedení a synaptogenezi [10–12] prostřednictvím interakce s jeho receptory odstraněny u kolorektálního karcinomu (DCC) a UNC5H (nekoordinovaný-5 homolog), aby se aktivovalo přežití, diferenciace a proliferace buněk [13–15].

Receptory indukují signál smrti ke zprostředkování apoptózy, když Netrin-1 chybí [16]. Je známo, že vazba Netrinu-1 s DCC má za následek dimerizaci DCC a iniciuje tyrosin 861 fosforylaci fokální adhesionkinázy (FAK) k indukci růstu neuritů a axonálního vedení [17,18].

Vazba Netrin-1 s DCC zahrnuje doménu EGF3 Netrin-1 a doménu FN5 DCC při aktivaci signální dráhy Netrin-1 [19,20]. Nedávno bylo prokázáno, že Netrin-1 má neuroprotektivní účinky v ischemických oblastech [21].

Hladina exprese Netrinu-1 v séru, který inhibuje buněčnou apoptózu a podporuje neuronální regeneraci, pozitivně koreluje se zotavením pacienta z ischemické cévní mozkové příhody [22,23].

Zajímavé je, že transplantace mezenchymálních kmenových buněk kostní dřeně, které vylučují Netrin-1 do poškozeného sedacího nervu potkana, iniciuje axonální regeneraci [24] a snižuje smrt motorických neuronů [25]. Stereotaxická injekce proteinu Netrin-1 do komor snižuje smrt nervových buněk po subarachnoidálním krvácení prostřednictvím aktivace signalizace DCC/APPL1/AKT [26].

Polypeptid odvozený z domény EGF3 Netrinu-1 (aminokyseliny 423–433) výrazně aktivuje fosforylaci ERK a podporuje produkci NO, který má kardioprotektivní účinky [27,28]. Nicméně Netrin-1 byl identifikován jako potenciální biomarker pro tumorigenezi [29–31], protože regulace statusu Netrin-1 se nachází u více tkáňových nádorů [32].

Když se Netrin-1 naváže na svůj receptor DCC nebo Unc5H, tyto receptory přenášejí pozitivní signál vedoucí k přežití, zánětu, angiogenezi a antiapoptóze, což zase reguluje tumorigenezi [31].

Proto je velmi důležité identifikovat minimální funkční doménu Netrinu-1, která může zachovat neuroprotekci a vyhnout se hlavním vedlejším účinkům Netrinu-1. Zde jsme zjistili, že peptid E1 (zbytky 407–422), který je odvozen z domény EGF3 Netrinu-1, interaguje s DCC a chrání neurony před toxicitou vyvolanou heminem.

V experimentálním modelu ICH myší aplikace peptidu E1 zlepšila funkční zotavení, jak bylo určeno behaviorálními testy. Kromě toho může peptid E1 zabránit degeneraci neuronů po ICH.

Na základě těchto výsledků jsme identifikovali funkční sekvenci Netrinu-1, která se podílí na zotavení po ICH, a určili jsme, že tento peptid lze použít k léčbě ICH.

2. Výsledky

2.1. Doména EGF3 je kritická pro interakci Netrin-DCC

Netrin-1 se skládá z domény VI, tří repetic EGF a C-terminální domény [33]. Krystalická struktura lidského komplexu Netrin-1/DCC odhaluje, že pro interakci Netrin-1/DCC je klíčová doména Netrin-1 EGF3, nikoli však domény EGF1 a EGF2 [34].

Mutageneze klíčových aminokyselinových zbytků (His407, Gln442 nebo Gln443) na doméně EGF3 zcela narušila vazbu Netrin-1/DCC [19]. Domény EGF1/2 jsou nutné pro přepnutí atraktivní signalizace na odpudivou signalizaci, když Unc5 koexistuje s DCC [20].

Nejprve jsme tedy vytvořili kompletní a EGF 3-deletované (Netrin-1 ∆407–443) konstrukty Netrin-1 (obrázek 1A) a přechodně exprimovali tyto konstrukty v kultivovaných buňkách HEK293T pro GSTpulldown .

Vazba byla pozorována u konstruktů, které exprimovaly Netrin-1, ale nikoli Netrin-1(∆407–443) (obrázek 1C). Tyto výsledky naznačují, že doména EGF3 obsahující aminokyseliny 407–443 je zodpovědná za interakci Netrin-1 s DCC. Abychom prozkoumali roli domény EGF3 v Netrin-DCC, nejprve jsme vyčistili myc-taggedNetrin{{12 }} nebo zkrácený Netrin-1 (∆407–443) (obrázek 1B).

Dále byly buňky HEK293T transfekovány plazmidem nesoucím DCC cDNA a inkubovány s proteinem Netrin-1 a poté byla vazba Netrin-1 hodnocena imunobarvením.

Zjistili jsme, že Netrin v plné délce-1, ale ne zkrácený Netrin-1, se dokázal vázat na DCC na plazmatické membráně (obrázek 1D). Abychom určili, zda doména EGF3 může interagovat s DCC, vytvořili jsme konstrukt GST-EGF3 ke stažení lyžovaných buněk nadměrně exprimujících DCC. Pozorovali jsme specifickou vazbu DCC s GST-EGF3 (obrázek 1E).

Dále jsme syntetizovali peptidEGF3 značený FITC a potvrdili, že stejně jako Netrin v plné délce-1 byl schopen se vázat na DCC na plazmatické membráně (obrázek 1F). Celkově naše data naznačují, že doména EGF3 je zodpovědná za interakci Netrin-1 s DCC.

2.2. Doména EGF3 indukuje fosforylaci downstream drah Netrinu-1

Interakce Netrin{0}} a DCC aktivuje několik signálních drah, včetně FAK, SFK a ERK [16,35]. Fokální adhezní kináza (FAK) je jednou z hlavních aktivit tyrosinfosforylace spojených se signalizací Netrin-1/DCC.

Netrin-1 aktivuje fosforylaci FAK a fosforylaci protein tyrosinkináz rodiny Src (SFKs) [17]. Signální dráhy FAK i SFK hrají klíčovou roli ve vývojové fázi nervového systému a při opravě poranění [36,37]. Netrin-1 navíc může aktivovat extracelulárním signálem regulovanou kinázu-1/2 (ERK1/2), která zprostředkovává působení mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK) [38–40].

Abychom zjistili, zda je doména EGF3 kritická pro aktivaci následných signálních drah prostřednictvím vazby Netrinu-1 na DCC, nejprve jsme zkoumali účinek domény EGF3 na fosforylaci tyrosinu 861 FAK (obrázek 2A) . Zjistili jsme, že delece EGF3 inhibovala fosforylaci FAK v kultivovaných kortikálních neuronech (obrázek 2B, C), čímž jsme potvrdili zásadní roli EGF3 v signální dráze Netrin-1.

Dále byly kultivované kortikální neurony stimulovány fúzním proteinem GST-EGF3 po dobu 20 minut a western blotting dále potvrdil, že léčba fúzním proteinem GST-EGF3 indukovala fosforylaci FAK, ERK a SFK (obrázek 2D–G).

Tyto výsledky naznačují, že doména EGF3 Netrin-1 funguje jako silný stimulátor k aktivaci downstream signálních drah.

Obrázek 1. Doména EGF3 Netrin-1 je kritickou oblastí pro interakci Netrin-1/DCC. (A) Ilustrace Netrin-1konstruktů. Konstrukty Netrin-1 jsou Netrin-1 plné délky, Netrin-1-(∆407–443) a GST-EGF3. (B) Purifikovaný Netrin-1-(∆407–443)-Myc/His byly kvantifikovány prostřednictvím srovnání se standardní křivkou BSA. (C) Imunoblotování stahovací frakce fúzním proteinem domény FN5 GST-DCC a samotným GST. (D) Imunofluorescenční snímky Flag-DCC exprimujících 293T buněk inkubovaných s kontrolním médiem, Netrin-1-myc/his a Netrin{23}}(∆407–443) -Myc/his po dobu 30 minut, v tomto pořadí a kvantitativní analýza. Měřítko, 10 µm. (E) Imunoblotování stahovací frakce fúzním proteinem GST-EGF3 a GST. (F) Imunofluorescenční snímky Flag-DCC exprimujících 293T buněk inkubovaných s kontrolním médiem a FITC značeným Pep EGF3 po dobu 30 minut a kvantitativní analýza. Měřítko, 10 µm.

Obrázek 2. Doména EGF3 aktivuje downstream cesty Netrinu-1. (A) Experimentální postup. (B) Kortikální neurony (E17 a DIV3) byly stimulovány Netrinem-1, Netrinem-1-(∆407–443) nebo kontrolním médiem po dobu 20 min. Buněčné lyzáty byly inkubovány s anti-p-FAK-861 protilátkou pro potvrzení aktivity Netrin{13}}. (C) Kvantitativní analýza výsledků western blotu je uvedena v (B). n=3. (D) Kortikální neurony (DIV3) byly ošetřeny 1,5 uM GST (+), 1,5 uM GST-EGF3 fúzním proteinem (+) nebo 1,5 uM Netrin-1 (+) médiem po dobu 20 minut. Buněčné lyzáty byly inkubovány s anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 a anti-p-ERK-202/204.(E–G) Kvantitativní analýza západní výsledky blotu uvedené v (D). n=3. Data jsou prezentována jako průměr ± SEM. Jednocestná ANOVA byla použita pro všechny statistické analýzy uvedené na tomto obrázku (* p < 0,05,** p < 0,01; ns, nevýznamné). Podrobnosti analýzy dat jsou uvedeny v doplňkové tabulce S1.

2.3peptid E1 a E2 interagují s DCC a aktivují downstream signální cestu Netrinu-1

Jak bylo popsáno dříve, malý peptid odvozený z domény EGF3 Netrin-1 (aminokyseliny 423–433) indukoval fosforylaci ERK [27]. Syntetizovali jsme peptidy E1 (zbytky 407–422) a E2 (zbytky 423–433), které byly odvozeny z domény EGF3 Netrinu-1 (obrázek 3A).

Zjistili jsme, že inkubace peptidu E1 zvýšila hladiny fosforylovaného FAK a SFK (obrázek 3B, D, E) v kultivačních buňkách způsobem závislým na dávce, ale nezměnila hladiny fosforylovaného ERK (obrázek 3B, F).

Na rozdíl od peptidu E1 peptid E2 nejen indukoval fosforylaci tyrosinu FAK (obrázek 3C, G) a fosforylaci tyrosinu SFK (obrázek 3C, H), ale také indukoval fosforylaci tyrosinu ERK (obrázek 3C, I) v kultivovaných kortikálních neuronech.

Kontrolní peptid (Pep Ctrl) neměl žádný detekovatelný účinek na fosforylaci tyrosinu FAK, SFK a ERK (obrázek S1). Dále jsme pozorovali, že fosforylace složek signální dráhy FAK indukované peptidem E1 byla časově závislá (obrázek S1). S2). Tyto výsledky ukazují, že E1 a E2 jsou minimální funkční peptidy Netrinu-1.

Obrázek 3. Minimální sekvence domény EGF3 aktivují downstream cesty Netrinu-1. (A) Ilustrace peptidů. (B) Kortikální neurony (DIV3) byly stimulovány gradientovými koncentracemi peptidu El. Buněčné lyzáty byly inkubovány s anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 a anti-p-ERK-202/204. (C) Kultivované kortikální neurony byly ošetřeny gradientovými koncentracemi peptidu E2.

Lyzáty byly shromážděny a inkubovány s uvedenými protilátkami pro měření fosforylace FAK, SFK a ERK. (D–F) Kvantifikace rozsahu fosforylace FAK, SFK a ERK indukované peptidem E1 v neuronech je uvedena v (B). n=3. (G–I) Kvantifikace rozsahu fosforylace FAK, SFK a ERK indukované peptidem E2 je uvedena v (C). n=3. (J) Kortikální neurony odvozené z DCC divokého typu a homozygotních mutantních embryí byly stimulovány peptidy odvozenými od Netrin-1 nebo Netrin{6}}a byly lyžovány.

Výsledné lyzáty byly podrobeny imunoblotu. (K) Kvantifikace hladin FAK PY{{0}} a DCC v neuronech mutantů DCC je uvedena v (J). n=3. Data jsou prezentována jako průměr ± SEM. Jednocestná ANOVA byla použita pro všechny statistické analýzy uvedené na tomto obrázku (* p < 0,05; ns, nevýznamné). Podrobnosti analýzy dat jsou uvedeny v doplňkové tabulce S1.

Abychom určili, zda je aktivace signální dráhy FAK závislá na DCC, měřili jsme rozsah tyrosinové fosforylace FAK indukované těmito peptidy v neuronech DCC+/+ a DCC−/−. Zjistili jsme, že oba peptidy E1 a E2 nedokázaly vyvolat fosforylaci FAK v DCC-/- neuronech (obrázek 3J, K).

Také jsme zjistili, že syntetizované N-koncově Flag-značené peptidy El a E2 (Flag-E1 a Flag-E2) se přímo vážou s doménou DCCFN5 (obrázek S3).

2.4. Peptid E1 chrání neurony před smrtí buněk indukovanou heminem in vitro

Abychom prokázali ochranu peptidu E1 proti neuronálnímu poškození, použili jsme aHeminem indukovatelnou toxickou reakci k napodobení sekundárního poškození mozku po intracerebrální hemoragii [41,42].

Kultivované neuronové buňky exprimující GnRH (NLT) [43–45] byly inkubovány s heminem v různých koncentracích a trváních. Inkubace buněk NLT s heminem při střední letální dávce (60 uM) vedla k časově závislému snížení míry přežití buněk, což naznačuje, že hemin byl vychytáván neurony a metabolizován (obrázek S4).

Aby se zjistilo, zda exprese Netrin{0}} a DCC reagovala na smrt neuronových buněk vyvolanou heminem, byly kultivované buňky NLT inkubovány s heminem po různou dobu. Výsledky western blotu ukázaly, že hladiny exprese Netrin-1 a DCC byly významně zvýšeny 6 hodin po inkubaci heminu a poté postupně klesaly (obrázek 4A, B).

Abychom prozkoumali, zda jsou peptidy E1 a E2 schopny zeslabit heminem indukovanou neuronální smrt, provedli jsme CCK-8 test s Netrin-1, PepCtrl, peptidem E1 a peptidem E2.

Zjistili jsme, že tyto peptidy nemají žádný detekovatelný účinek na životaschopnost buněk (obrázek 4C a obrázek S5). Ve srovnání s inkubací s Pep Ctrl a peptidemE2, peptidy E1 a Netrin-1 zlepšily neuronální smrt vyvolanou heminem (obrázek 4D). Také jsme barvili kalceinem-AM a PI, abychom rozlišili živé a mrtvé buňky.

Výsledky ukázaly, že jak Netrin{0}}, tak peptid E1 chránily před smrtí vyvolanou heminem in vitro (obrázek 4E–G). Kromě toho 1,5 uM peptid El zmírnil heminem indukovanou smrt v primárně kultivovaných neuronech (obrázek 4H, I). Celkově tyto výsledky ukázaly, že peptid E1 chrání neurony před heminem indukovanou buněčnou smrtí.

2.5. Netrin-1-Odvozený peptid E1 podporuje funkční zotavení po ICH

Abychom prozkoumali, zda peptid E1 odvozený z Netrin-1 hraje důležitou roli při nefunkčním zotavení po hemoragické mrtvici, vytvořili jsme experimentální model ICH inmice injekcí kolagenázy smíchané s inkoustem do striata (obrázek S6A).

Po třech dnech se ukázaly obrazy řezu mozku, které sledovaly polohu injekce a objem kolagenázy pomocí inkoustu (obrázek S6B, C). Myši se striatálním krvácením vykazovaly slabost na ipsilaterální straně kvůli poranění mozku (obrázek S7A–C).

Hematom ve striatum po ICH byly viditelné ve srovnání s injekcí fyziologického roztoku (obrázek S7D). Relativní hladiny proteinu Netrin-1 a DCC v perihematomálním kortexu byly u myší ICH ve srovnání s kontrolními myšmi zvýšeny 2. den a Netrin-1 byl stále významně vyšší 3. den, což naznačuje, že Netrin-1 je důležitý pro zotavení poranění mozku (obrázek S7E, F).

Dále, FITC-značený TAT-peptid E1 (FITC-Pep TE1), který přidal TAT sekvenci N-konce peptidu E1, byl injikován do ICH myší a ukázalo se, že FITC-Pep TE1 prochází hematoencefalickou bariérou ( Obrázek S8).

ICH a kontrolním myším byl denně intraperitoneálně injikován peptid (12 mg/kg) nebo stejný objem fyziologického roztoku (obrázek 5A). Zjistili jsme, že podávání peptidu TE1 zlepšilo míru přežití a zachránilo defekty tělesné hmotnosti po ICH (obrázek 5B, C).

Také jsme zjistili, že objem kolagenázy sledovaný se stejným poměrem inkoustu v každé skupině byl podobný, což potvrzuje, že tento standardní ICH model kolagenázy vedl k reprodukovatelným intrastriatálním hematomům (obrázek 5D). Peptid TE1 zlepšil skóre chování myší ICH v testu odstranění pásky (obrázek 5E ) a test válce (obrázek 5F).

Jak se očekávalo, peptid TE1 redukoval infarkt po ICH (obrázek 5G, H). Dohromady tyto výsledky naznačují, že peptid E1 byl schopný snížit objem hematomu a zlepšit funkční zotavení v myším modelu ICH.

Obrázek 4. Peptid E1 zlepšuje heminem indukovanou buněčnou smrt in vitro. (A) Western blot Netrin-1 a DCC v kultivovaných buňkách NLT vystavených heminu (60 µM). (B) Kvantitativní analýza výsledků western blotres je uvedena v (A). n=3. (C) CCK-8 testy ukázaly, že série peptidů neměnila buněčnou životaschopnost. n=4. (D) 1,5 uM Pep E1 zachovalo životaschopnost buněk NLT, když bylo přidáno dobře po expozici heminu (60 uM). n=4. (E) Živý (zelený)/mrtvý (červený) test buněk NLT vystavených heminu (60 uM, 6 h). Měřítko, 50 µm. (F, G) Kvantitativní analýza testu živých/mrtvých v (E). n=9. (H) CCK-8testy ukázaly, že Pep E1 může snížit heminem indukovanou buněčnou smrt v neuronech primární kultury. n=8.(I) Živé/mrtvé zobrazení neuronů primární kultury (50 uM, 6 h). Měřítko, 50 µm. Data jsou uvedena jako průměr ± SEM. Jednocestná ANOVA nebo dvoucestná ANOVA byla použita pro všechny statistické analýzy uvedené na tomto obrázku (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, nevýznamné). Podrobnosti analýzy dat jsou uvedeny v doplňkové tabulce S1.

Obrázek 5. Peptid E1 odvozený od Netrinu-1- podporuje proces obnovy po ICH. (A) Schéma experimentálního paradigmatu intraperitoneální (IP) injekce peptidu TE1 v ICH modelování myší. (B) Byl zaznamenán poměr přežití po ICH každé skupiny a byla použita Kaplan-Meierova metoda. n=10. (C) Změny tělesné hmotnosti 5 dní po ICH. n=6.(D) Směs koláže/fyziologického roztoku se stejným poměrem inkoustu (celkem 0,6 µL) vstříknutým do striata myší C57, reprezentativní snímky zobrazující oblast inkoustu byly podobné u myší léčených/ bez peptidu TE 1 5 dní po ICH. (E, F) IP injekce peptidu TE1 (12 mg/kg), ale ne TAT (12 mg/kg), kontrola, zlepšené chování, jak bylo monitorováno úkolem odstranění pásky (E) nebo rohovým úkolem (F).

Fyziologický roztok,n=10 jednotlivých zvířat; ICH, n=6 jednotlivých zvířat; ICH + TAT, n=6 jednotlivých zvířat; ICH + TE1, n=8 jednotlivých zvířat. (G) Reprezentativní řezy barvené hematoxylinem a eosinem u myší léčených/bez peptidu TE 1 5 dní poICH. Měřítko, 1 mm. (H) Kvantifikace objemu krvácení v řezech mozku znázorněných na (G).

Fyziologický roztok, n {{0}} jednotlivých zvířat; ICH, n=6 jednotlivých zvířat; ICH + TAT, n=6 jednotlivých zvířat; ICH + TE1, n=8 jednotlivých zvířat. Data jsou uvedena jako průměr ± SEM. Jednocestná ANOVA nebo dvoucestná ANOVA byla použita pro všechny statistické analýzy uvedené na tomto obrázku (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, není významný). Podrobnosti analýzy dat jsou uvedeny v doplňkové tabulce S1.

2.6. Netrin-1-Odvozený peptid E1 snižuje neuronální apoptózu po ICH

Prozkoumat základní mechanismy peptidu E1 v procesu funkční obnovy ICH. Zjistili jsme neuronální degeneraci v perihematomální oblasti barvením fluoro-jade C (FJC).

Zjistili jsme, že podávání peptidu TE1 významně snížilo počet FJC-pozitivních buněk v perihematomových oblastech, což ukazuje, že pep TE1 inhiboval neuronální degeneraci po ICH (obrázek 6A, B). Provedli jsme barvení TUNEL a zjistili jsme, že peptid TE1 významně snížil počet TUNEL-pozitivních neuronů (obrázek 6C, D).

Počet TUNEL-pozitivních astrocytů nebyl detekovatelnou změnou po léčbě peptidem TE1 (obrázek 6E, F). Kromě toho jsme použitím 4kDa dextranu značeného FITC jako atraceru k indikaci permeability hematoencefalické bariéry (BBB) ​​zjistili, že peptid TE1 neovlivňuje obnovení permeability BBB (obrázek S9A, B).

Hladiny surových fluorescenčních jednotek (RFU) v séru byly podobné, což potvrdilo přítomnost injikovaného indikátoru u všech analyzovaných zvířat (obrázek S9C). Také jsme použili fluoresceinem značený lektin ke značení mikrocév, ale nepodařilo se nám pozorovat žádné zlepšení po ošetření TE1 (obrázek S9D, E). Tato zjištění především naznačují, že peptid E1 podporuje obnovu neuronů po ICH inhibicí apoptózy neuronů.

Obrázek 6. Peptid E1 odvozený od Netrinu-1- může chránit před neuronální smrtí a degenerací, ale ne astrocyty po ICH.(A) Reprezentativní řezy barvené fluoro-jade C u myší léčených/bez TE1 5 dní po ICH. Měřítko, 50 µm, respektive 10 µm. (B) Kvantifikace buněk pozitivních na fluoro-jade C v perihematomální oblasti (n=4). (C) Barvení TUNEL ukazující účinky TE1 na sekundární poškození mozku (SBI) 5 dní po nástupu ICH. Reprezentativní snímky ze skupin Saline, ICH, ICH + TAT a ICH + TE1.

Každá skupina byla podrobena ICH kromě skupiny s fyziologickým roztokem. Měřítko, 50 µm, respektive 10 µm. (D) Kvantitativní analýzy procenta TUNEL-pozitivních neuronů jsou uvedeny v (C). n=4. (E)Kolokalizace TUNELu s GFAP 5 dní po ICH. Reprezentativní snímky ze skupin Saline, ICH, ICH + TAT a ICH + TE1. Měřítko, 50 µm, respektive 10 µm. (F) Kvantitativní analýzy procenta TUNEL-pozitivních astrocytů jsou uvedeny v (E). n=4. Data jsou uvedena jako průměr ± SEM.

Jednosměrná ANOVA byla použita pro všechny statistické analýzy zobrazené na tomto obrázku (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, nevýznamné; Podrobnosti analýzy dat jsou uvedeny v doplňkové tabulce S1.

3. Diskuse

Naše studie identifikovala hlavní peptidovou sekvenci Netrin-1, která je zásadní pro funkční zotavení po ICH. Interakcí s DCC tento peptid odvozený od Netrin-1-chrání před smrtí neuronů v důsledku sekundárního poškození po ICH, a je tedy slibnou léčbou pro ICH.

Terapeutická aplikace Netrinu-1, vysokomolekulárního proteinu, vyžaduje identifikaci minimální funkční sekvence Netrinu-1, která podporuje sestupnou signalizaci. V naší studii byly vytvořeny peptidy E1 (zbytky 407–422) a E2 (zbytky 423–433), které jsou odvozeny z domény EGF3 Netrinu-1. Zjistili jsme, že peptid E1 (zbytky 407–422) chrání před neuronální smrtí po ICH.

Zjistili jsme, že hladiny exprese Netrin{0}} a DCC byly zvýšeny v buňkách NLT po léčbě heminem. Hemin se uvolňuje z hemoglobinu po ICH a indukuje sekundární poškození gliových i neuronálních buněk [46–48].

Kromě toho jsme také pozorovali zvýšené hladiny proteinů Netrin{0}} a DCC po experimentální ICH. Kromě toho jsme také pozorovali zvýšené hladiny proteinu netrin-1 a DCC po experimentální ICH.

Tyto výsledky jsou v souladu s předchozími výsledky, které ukazují, že netrin{0}} hraje důležitou roli při zotavení po ICH [49].

For more information:1950477648nn@gmail.com