Nový Netrin-1-odvozený peptid zvyšuje ochranu před smrtí neuronů a zmírňuje intracerebrální krvácení u myší, část 3

Léčebné skupiny s fyziologickým roztokem, TAT nebo TE1 (rozpuštěným ve fyziologickém roztoku) byly podávány myším 2 hodiny po ICH a každý den po dobu 5 dnů intraperitoneální injekcí v celkovém objemu 0,1 ml na zvíře. Peptidy byly podávány zaslepeným způsobem v dávkách 12 mg/kg.

Fyziologický solný roztok je běžně používaný fyziologický pufr, široce používaný v lékařských a biologických experimentech. Ale věděli jste? Fyziologický solný roztok může také zlepšit naši paměť!

Za prvé, fyziologický roztok hraje důležitou roli v normální funkci buněk. Dokáže udržovat normální buněčný osmotický tlak a udržovat normální morfologii a funkci buněk. V mozku potřebuje velké množství nervových buněk fyziologický roztok jako základní látku a doplnění fyziologického roztoku může podpořit normální činnost mozkových buněk, zajistit mozku dostatek kyslíku a živin a učinit mozek zdravějším.

Za druhé, fyziologický roztok může podporovat přenos signálu mezi mozkovými neurony a zlepšit schopnost mozku učit se. Studie ukázaly, že v procesu učení úkolů může injekce fyziologického roztoku významně zlepšit učební efekt studentů a zlepšit emoční stav studentů, snížit úzkost a stres z učení. Současně může fyziologický roztok také zvýšit počet neuronů a komplexnost neuronů v hipokampu, což přispívá k vytváření a udržování paměti.

Kromě toho může fyziologický roztok zlepšit metabolické prostředí mozku a snížit různé škodlivé účinky na mozek, jako je poškození, léze, ischemie a hypoxie. To jsou faktory, které mohou poškodit mozek, a injekce fyziologického roztoku může zlepšit schopnost mozku vyrovnat se a snížit jeho poškození, čímž zlepší paměť a schopnost myšlení mozku.

Obecně je fyziologický roztok ideální látkou pro zlepšení paměti. Může mít více pozitivních účinků na mozek, včetně zvýšení počtu a složitosti neuronů, zlepšení metabolického prostředí a podpory přenosu signálu mezi neurony. Proto, když potřebujeme zlepšit svou paměť, můžeme také zvážit injekční podání fyziologického roztoku, který poskytne lepší ochranu a podporu našemu mozku. Je vidět, že potřebujeme zlepšit naši paměť a Cistanche může výrazně zlepšit naši paměť, protože dokáže také regulovat rovnováhu neurotransmiterů, jako je zvýšení hladiny acetylcholinu a růstových faktorů, které jsou velmi důležité pro paměť a učení. Kromě toho může Cistanche také zlepšit průtok krve a podpořit dodávku kyslíku, což může zajistit, že mozek získá dostatečnou výživu a energii, a tím zlepší mozkovou vitalitu a vytrvalost.

Klikněte na možnost poznat způsoby, jak zlepšit svou paměť

4.13. Myší model ICH indukovaný kolagenázou

K indukci ICH se běžně používá injekce kolagenázy [60]. Samci myší C57BL/6 (ve věku 8 až 12 týdnů) byli anestetizováni isofluranem (2 až 5 %) a umístěni na stereotaxický rám.

Během procedury byla tělesná teplota každého zvířete udržována na 37 ◦C pomocí homeotermické přikrývky. Pomocí stereotaktického nástroje (Ruiwode Life ScienceCo., Ltd., Shenzhen, Čína) a injekční stříkačky (Hamilton Company, Reno, NV, USA) 0,3 µLof kolagenázy (0).{12 }} 45 IU Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) bylo podáno infuzí do righttriatum (AP: +0,2 mm; ML: -2,3 mm; DV: -3,5 mm) při průtokové rychlosti }} 0,1 ul/min.

Kontrolním zvířatům bylo infundováno celkem 0,3 ul fyziologického roztoku. Všechny chirurgické zákroky byly prováděny za aseptických podmínek. V této studii bylo použito přes 66 myších samců a zvířata byla před každým experimentem náhodně rozdělena do skupin [57].

4.14. Behaviorální analýza

Neurologická behaviorální analýza myší po vytvoření mozkového hematomu byla detekována testem odstranění lepicí pásky [61] a cylindrovým testem [60]. Test odstranění zkoseného lepidla byl proveden umístěním lepicí pásky na oblast plantážníku každé přední tlapky (pravé a levé) myši.

Každá myš byla umístěna do nové klece.

Pro každou tlapku byl zaznamenán čas od přiložení pásky do doby, kdy ji myš úspěšně odstranila. Na každou tlapku bylo povoleno maximálně 300 s. Mezi experimenty byla zvířata umístěna ve svých domácích klecích v zařízení bez patogenů.

Válcový test byl proveden umístěním myši do průhledného akrylového skleněného válce (průměr: 8 cm; výška: 25 cm) před 2 zrcadly a kamerou na 5 minut. Kamera byla umístěna centrálně před 2 zrcadly a válcem pro získání optimálního videa.

Pro hodnocení nezávislého použití přední končetiny byla hodnocena (1) schopnost myší dotknout se stěny válce jednou přední končetinou během úplného vzpřímení a (2) schopnost myší přistát pouze jednou přední končetinou na podlaze po úplném vychování. Pomocí pomalého pohybu bylo spočítáno alespoň 20 kontaktních bodů pro každou přední končetinu.

Pro základní analýzu před operací byl test proveden dvakrát na myš s 1 hodinovou přestávkou mezi studiemi. Přední končetina je vyjádřena jako poměr nezávislého použití pravé a levé přední končetiny.

4.15. Analýza objemu hematomu

Pro stanovení, zda ošetření snížilo objem hematomu, byly myši usmrceny 5 dní po ICH; mozky byly vyjmuty a bleskově zmraženy v OCT. Koronální řezy byly nakrájeny na tloušťku 30 um a umístěny přímo na sklíčka. Pro kvantifikaci objemu hematomu byly řezy digitalizovány na standardizovaných koronálních úrovních.

Slepý uživatel změřil obrysy a hematom v levé a pravé hemisféře v každém řezu. Objem hematomu a otok byly měřeny a vypočteny pomocí ImageJ (NIH).

Nejméně 5 mozků na skupinu bylo podrobeno měření hematomu a objem hematomu byl měřen v celém mozku.

4.16. Barvení Fluoro-Jade C

Neurodegenerace u myší po kolagenázou indukované ICH byla hodnocena barvením pomocí soupravy Fluoro-jade C Ready-to-Dilute Stained Kit (TR-100-FJT, Biosensis, Thebarton, Austrálie) podle protokolu výrobce [62].

Stručně, kontrolní myši a ICHmyši (±ip peptid) byly usmrceny 5 dní po modelování a mozky byly zpracovány podle protokolu použitého pro imunocytochemický experiment.

Plovoucí mozkové řezy byly ponořeny do 1% roztoku hydroxidu sodného na 5 minut, oplachovány 2 minuty v 70% ethanolu a poté 2 minuty oplachovány v destilované vodě. Poté byly plovoucí sekce ponořeny do 0,06% roztoku manganistanu draselného (KMnO4 v destilované vodě) na 10 minut.

Řezy byly promyty ddH2O před ponořením do 0,0001% roztoku pro barvení Fluoro-Jade (Fluoro-Jade C v destilované vodě) po dobu 20 minut za mírného třepání ve tmě.

Řezy byly promyty ddH20, upevněny na potažená sklíčka a sušeny při pokojové teplotě přes noc ve tmě. Barvení Fluoro-Jade C v perihematomální oblasti bylo zkoumáno pomocí konfokálního mikroskopu Zeiss LSM 880. Kvantifikace Cbarvení fluoro-nefritem byla provedena pomocí softwaru ImageJ.

4.17. Imunofluorescence tkání

Tkáňové imunofluorescenční barvení bylo provedeno s použitím série 30-µm silných řezů. Řezy byly inkubovány s následujícími primárními protilátkami: myší antiNeuN (1:500, Millipore, MAB377, Billerica, MA, USA) nebo myší anti-GFAP (1:200, SigmaAldrich, G3893, St Louis, MO, USA) ve 4. ◦C přes noc. Po promytí PBS byly řezy inkubovány s Alexa Fluor 488-konjugovanou oslí anti-myší (1:1000; Invitrogen, A21202, Carlsbad, CA, USA) protilátkou.

4.18. TUNEL test

Test terminálního deoxynukleotidyltransferázou zprostředkovaného deoxyuridintrifosfátu (dUTP) nick end-labeling (TUNEL) byl použit k identifikaci apoptotických buněk s jadernou DNAfragmentací v perihematomální oblasti mozku.

Barvení bylo provedeno pomocí komerční soupravy pro jednokrokový test apoptózy TUNEL (Beyotime, C1090, Nanjing, Čína) a provedeno podle pokynů výrobce. Po tkáňové imunofluorescenci byla provedena TUNELreaction.

Řezy mozku byly inkubovány s reakční směsí TUNEL (1 h při 37 °C) a poté byly řezy promyty PBS a kontrastně obarveny DAPI. Společná lokalizace barvení NeuN-TUNEL byla zkoumána pomocí konfokálního mikroskopu Zeiss LSM 880.

Neurony pozitivní na TUNEL (NeuN pozitivní) v perihematomální oblasti uvnitř striata byly kvantifikovány pomocí softwaru ImageJ na třech různých snímcích na myš pořízených pod objektivem 20X. Kolokalizace barvení GFAP-TUNEL byla podobná barvení NeuN-TUNEL.

4.19. In vivo test permeability hematoencefalické bariéry

In vivo byly provedeny testy permeability hematoencefalické bariéry, jak bylo popsáno dříve [63–65]. Stručně řečeno, kontrolní myši a ICH myši (±ip peptid) byly intraperitoneálně injikovány 4kDa dextranem značeným FITC (100 ul 2 mM zásobního roztoku v PBS, Sigma Aldrich, 46944-100 MG-F, St Louis, MO, USA) po modelaci 5 dní, po 5 minutách anestezie.

Po cirkulační době 10 minut pro indikátor byla zvířata připravena pro transkardiální perfuzi a ~ 300 ul krve bylo odebráno z hrudní dutiny těsně po atriální punkci, následovala perfuze po dobu 3 minut PBS. Hemimozek (bez čichových laloků, mozečku a zadního mozku) a jedna ledvina byly odebrány a okamžitě zmraženy tekutým dusíkem a skladovány při -80 ◦C.

Pro měření fluorescence byly vzorky rozmraženy na ledu, zváženy a homogenizovány v PBS (400 ul pro hemicerebrum a 600 ul pro ledviny), poté následovala centrifugace po dobu 20 minut při 4 °C a 15,000×g.

Supernatanty (100 ul), stejně jako stejné objemy séra (1/5 ředění v PBS), byly naneseny do 96-jamkové černé destičky a fluorescence byla měřena při odpovídající excitaci (490 nm)/emise (520 nm ) ve čtečce destiček (Tecan, Männedorf, Švýcarsko). K odečtení hodnot autofluorescence byla použita simulovaná zvířata (bez tracerinjekce). Index permeability (ml/g) byl vypočten jako poměr tkáňových RFU/g hmotnosti tkáně k sérovým RFU/ml séra.

4.20. Fluorescenční lektinové barvení

K vizualizaci mozkových mikrocév jsme použili lektin Lycopersicon esculentum konjugovaný s fluoresceinem (1:200, Vector Laboratories, FL-1171, Burlingame, CA, USA) k ponoření plovoucích řezů po dobu 1 hodiny.

Řezy byly zobrazeny na konfokálním mikroskopu Zeiss LSM 880 pod objektivem 20× a snímky byly zpracovány s nastavením 1,3 gama. Byly pořízeny tři snímky ze 3 předem specifikovaných oblastí v perihematomální oblasti koronálního mozku pera. Body větvení cév byly kvantifikovány v každém mozku zaslepeným výzkumníkem. Bod větvení byl definován jako jediná céva značená fluoresceinem, která se znatelně rozděluje na 2 odlišné a samostatné dráhy cév [66].

4.21. Statistická analýza

Všechny experimentální postupy byly prováděny naslepo a prováděny 3krát nezávisle, jak bylo popsáno dříve [67]. Data jsou uvedena jako průměr ± SEM. Statistická analýza byla provedena jednocestnou ANOVA, dvoucestnou ANOVA a Studentovým testem podle potřeby za použití GraphPad Prism v7 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA ) a software SPSS verze 20.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).

Statistické parametry lze nalézt v příslušných legendách obrázků. Statistická významnost byla nastavena na *p < {{0}}.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.]

5. Závěry

Doména EGF3 Netrin-1 je klíčová pro interakci Netrin-1 s DCC a může aktivovat různé signální dráhy. Zkrácený peptid E1 Netrinu-1 (zbytky 407–422) interaguje s DCC a chrání neurony před toxicitou vyvolanou heminem.

Aplikace peptidu E1 zlepšuje funkční zotavení v experimentálním modelu ICH. Kromě toho může peptid E1 chránit neurony před degenerací a apoptózou po ICH.

Autorské příspěvky: Konceptualizace, LL, Z.-XH a X.-JZ; metodologie, LL, K.-JL a J.-BC; validace H.-LY a X.-XH; vyšetřování, X.-JZ; správa dat, JY; zdroje LL a Z.-XH; psaní LL, Z.-XH a X.-JZ; dozor, Z.-XH, X.-JZ; získání finančních prostředků, Z.-XHand X.-JZ Všichni autoři si přečetli a souhlasí s publikovanou verzí rukopisu.

Financování: Tento výzkum byl financován National Natural Science Foundation of China (31671065 and 32071018), Science and Technology Development Plan of Jilin Province (202520YY01017404).

Prohlášení Institutional Review Board: Všechny postupy byly schváleny Institutional Animal Careand Use Committee of Northeast Normal University (NENU/IACUC, AP2016200299). Národní standardy Čínské lidové republiky (GB/T 35892–2018), Směrnice pro laboratorní zvířata pro etické přezkoumání dobrých životních podmínek zvířat, byla vodítkem pro naši péči o zvířata a protokoly.

Prohlášení o informovaném souhlasu: Neuplatňuje se.

Poděkování: Tato práce byla podpořena Čínskou národní přírodní vědeckou nadací (31671065 a 32071018) a Plánem rozvoje vědy a technologie provincie Jilin (202520YY01017404).

Střet zájmů: Autoři neprohlašují žádný střet zájmů. Financovatelé neměli žádnou roli v návrhu studie; při shromažďování, analýzách nebo interpretaci dat; při psaní rukopisu nebo při rozhodnutí o zveřejnění výsledků.

Reference

1. Kirshner, HS Lékařský management intracerebrálního krvácení: Zpět k základům. Int. J. Clin. Praxe. 2008, 62, 521–522.[CrossRef] [PubMed]

2. Anderson, CS; Heeley, E.; Huang, Y.; Wang, J.; Stapf, C.; Delcourt, C.; Lindley, R.; Robinson, T.; Lavados, P.; Neal, B.; a kol. Rychlé snížení krevního tlaku u pacientů s akutním intracerebrálním krvácením. N. Engl. J. Med. 2013, 368, 2355–2365. [CrossRef][PubMed]

3. Qureshi, AI; Mendelow, AD; Hanley, DF Intracerebrální krvácení. Lancet (Lond. Angličtina) 2009, 373, 1632–1644. [CrossRef]

4. Keep, RF; Hua, Y.; Xi, G. Intracerebrální krvácení: Mechanismy poranění a terapeutické cíle. Lancet Neurol. 2012, 11 720–731. [CrossRef]

5. Schrag, M.; Kirshner, H. Management intracerebrálního krvácení: JACC Focus Seminar. J. Am. Kol. Cardiol. 2020, 75, 1819–1831.[CrossRef] [PubMed]

6. Kandasamy, R.; Idris, Z.; Abdullah, JM Chirurgie intracerebrálního krvácení. v neurovaskulární chirurgii chirurgické přístupy pro neurovaskulární onemocnění; July, J., Wahjoepramono, EJ, Eds.; Springer: Singapur, 2019; s. 201–210,7. Broughton,

7. Broughton, BR; Reutens, DC; Sobey, CG Apoptotické mechanismy po cerebrální ischemii. Mrtvice 2009, 40, e331–e339. [CrossRef][PubMed]

8. Kristiansen, M.; Graversen, JH; Jacobsen, C.; Sonne, O.; Hoffman, HJ; právo, SK; Moestrup, SK Identifikace receptoru lapače hemoglobinu. Příroda 2001, 409, 198–201. [CrossRef]

9. Madangarli, N.; Bonsack, F.; Dasari, R.; Sukumari-Ramesh, S. Intracerebrální krvácení: krevní složky a neurotoxicita.Brain Sci. 2019, 9, 316. [CrossRef]

10. Deiner, MS; Kennedy, TE; Fazeli, A.; Serafini, T.; Tessier-Lavigne, M.; Sretavan, DW Netrin-1 a DCC zprostředkovávají vedení axonů lokálně na optické ploténce: Ztráta funkce vede k hypoplazii zrakového nervu. Neuron 1997, 19, 575–589. [CrossRef]

11. Kennedy, TE; Serafini, T.; de la Torre, JR; Tessier-Lavigne, M. Netriny jsou difúzní chemotropní faktory pro komisurální axony v embryonální míše. Cell 1994, 78, 425–435. [CrossRef]

12. Flores, C. Role netrinu-1 v organizaci a funkci mezokortikolimbického dopaminového systému. J. Psychiatry Neurosci. Jpn.2011, 36, 296–310. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com