Nový Netrin-1-odvozený peptid zvyšuje ochranu před smrtí neuronů a zmírňuje intracerebrální krvácení u myší, část 2

Dále jsme zjistili, že peptid E1 specificky aktivoval signální dráhy FAK a SFK. Proto může mít peptid E1 vysoce specifické účinky a být účinný v procesu obnovy po ICH.

Existuje vztah mezi vysokou specificitou a pamětí. Vysoká specifičnost se týká silnější aktivity v určitých oblastech mozku, když lidé plní nějaký úkol. Paměť označuje schopnost lidí učit se a pamatovat si informace. Když se naučíme používat vysokou specifitu k provedení úkolu, zvýší se i naše paměť.

Výzkum ukazuje, že když máme specializované dovednosti a zkušenosti s určitým úkolem, mozek si postupně vybuduje specializované nervové obvody a paměťové vzorce. Tyto obvody a vzory budou mít specifický vliv na odezvu na úkol, čímž zlepší efektivitu úkolu. Zároveň při budoucím plnění podobných úkolů budou tyto obvody a vzory také aktivovány, aby nám pomohly lépe si úkol zapamatovat a provést.

Mezi úkoly s vysokou specifičností patří hudba, jazyk, sport atd. a učení se těmto dovednostem může zlepšit naši paměť. Například, když pianista cvičí hru, mozek se naučí specifické dovednosti klavíru a pokračuje v posilování těchto obvodů během procesu cvičení. Zavedení a posílení těchto okruhů také zlepší porozumění hudbě a paměť klavíristy.

Existuje tedy pozitivní vztah mezi vysokou specificitou a pamětí. Učení se specifickým dovednostem a zkušenostem může nejen zlepšit naši efektivitu provádění, ale také posílit naši paměť, což nám pomůže lépe se učit a pamatovat si různé informace. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche může výrazně zlepšit paměť, protože má antioxidační, protizánětlivé a anti-aging účinky, které mohou pomoci snížit oxidační a zánětlivé reakce v mozku, a tím chránit zdraví nervový systém. Kromě toho může Cistanche také podporovat růst a opravu nervových buněk, čímž zlepšuje konektivitu a funkci neuronových sítí. Tyto účinky mohou pomoci zlepšit paměť, schopnost učení a rychlost myšlení a mohou také zabránit výskytu kognitivní dysfunkce a neurodegenerativních onemocnění.

Klikněte na vědět doplňky pro posílení paměti

Na rozdíl od peptidu E1 může peptid E2 aktivovat signalizaci ERK, která podporuje smrt neuronů. To může být způsobeno motivinem E2 Cx(1–2)Cx(3–4)Tx(0 –1)G, který může aktivovat signální dráhu ERK [28].

To naznačuje, že různé peptidy odvozené od Netrinu{0}} vykonávají různé funkce. Hlavními receptory Netrin-1 jsou DCC a členové rodiny UNC5 [50]. Úloha DCC a UNC5H2 u ICH zůstává kontroverzní [51,52].

Sekvence Netrin-1, kterou jsme identifikovali, je kritická pro interakci Netrin-1 s DCC [19]. Tyto výsledky naznačují, že DCC se může podílet na Netrinem-1-indukovaném funkčním zotavení po ICH.

K prozkoumání základních mechanismů těchto procesů a souvisejících signálních drah jsou zapotřebí další studie. V budoucích experimentech budeme posuzovat biologické vlastnosti peptidu E1, abychom prozkoumali jeho toxicitu a poločas pro klinické použití.

4. Materiály a metody

4.1. Zvířata

Laboratoř byla laboratoř bez specifických patogenů (SPF). Všechny myši byly umístěny v 12-hodinovém cyklu světlo-tma se zapnutými světly od 6:00 do 18:00 a měly přístup k potravě ad libitum. DCC+/- myši byly vytvořeny tak, jak bylo popsáno dříve [53].

Pro kultivaci kortikálních neuronů byla použita embrya myší DCC+/−. Genotypizace byla provedena pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR), jak bylo popsáno dříve [53]. Myši C57BL/6J byly zakoupeny od společnosti Beijing Huafukang Bioscience Co., Ltd. (Peking, Čína).

4.2. Konstrukce

Expresní konstrukty kódující lidský DCC (HGNC: 2701), lidský Netrin-1 (HGNC:8029) a lidský UNC5A (HGNC:12567) byly vytvořeny v naší laboratoři [14,32,45].

pcDNA 3.1-hNetrin-1 (∆407–443)-myc-His byl vygenerován pomocí sady Seamless AssemblyCloning Kit (Clone Smarter, C5891, USA). cDNA sekvence hNetrinu-1 (∆407–443) byla vidět v doplňkové tabulce S2.

Sekvence cDNA odpovídající doméně FN5 DCC a aminokyselinám 407–443 Netrinu-1 byly zkonstruovány ligací do vektoru pGEX-5x-1 za vzniku fúzních proteinů GST.

4.3. Kolekce Netrin-1 Conditioned Medium

Netrin{0}}kondicionované médium bylo odebráno a ověřeno, jak je popsáno v naší předchozí zprávě [13,14]. Stručně řečeno, lidský Netrin-1 označený Myc-His byl exprimován v buňkách HEK293T.

Po 24 hodinách byly buňky 3krát promyty Opti-MEM (Invitrogen, 31985070, Carlsbad, CA, USA) a poté inkubovány po dobu tří dnů v Opti-MEM bez séra.

Médium bylo obohaceno odstředivou filtrací (Millipore, UFC903096, Billerica, MA, USA) a skladováno při -80 ◦C. Obohacený Netrin-1 byl imunoblotován s anti-His a kvantifikován srovnáním s BSA jako kontrolou nanášení.

Účinek Netrinu{{0}} byl poté hodnocen fosforylací FAK. Normálně 0,1 mg/ml Netrinu-1 účinně indukovalo fosforylaci FAK a tato koncentrace byla použita v našich studiích. Doba trvání stimulace Netrin-1byla ve všech experimentech 20 minut, pokud není uvedeno jinak.

4.4. Analýza Western Blot

Western blotting byl proveden, jak bylo popsáno dříve [54]. Vzorky byly lyzovány v lyzačním pufru (1% Nonidet P-40, 0,5% deoxycholát sodný, 0,1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, 10 % glycerol, 1 % Triton X-100, 100 mM NaF, 1 mM vanadičnan a inhibitory proteázy) k lýze buněk a čerstvé mozkové tkáně.

Primární použité protilátky byly: myší anti-DCC (1:500, #554223, BD, San Jose, CA, USA), myší anti-His (1:1000, TA-02, ZSGB-BIO, Peking, Čína ), myší anti-myc (1:1000, 22E8, Sungene Biotech,Tianjin, Čína), myší anti-Netrin-1 (1:1000, ALX804838, Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York, USA), myš anti-flag (1:1000, F3165, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA),králičí anti-fosfo-FAK(pTyr861) (1:1000, F9176, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA), králičí anti-FAK (1:200, sc-557, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA), králičí anti-fosfoSRC (Tyr418) (1:1000, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) , králičí anti-SRC rodina (1:1000,#2123, CST, Danvers, MA, USA), myší anti-GAPDH (1:5000, TransGene Biotech, Peking, Čína), myší anti-beta aktin (1:3000, A5441, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA), králičí anti-fosfo-ERK (Thr202/Tyr204) (1:1000, #9101, CST, Danvers, MA, USA), králičí anti-ERK (1:1000, # 4695, CST, Danvers, MA, USA), HRP-konjugované sekundární protilátky proti myším, kozím nebo králíkům byly zakoupeny od Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA).

4.5. Vazba na povrch buňky

Buňky HEK293 nanesené na krycí sklíčka byly transfekovány plazmidy Flag-DCC za použití metody fosforečnanu vápenatého, jak bylo popsáno dříve [55]. Přibližně 40 h po transfekci byly buňky inkubovány s 100 µg/ml myc-Netrinu-1 nebo myc-Netrinu-1 (∆407–443) po dobu 30 min před promýváním po dobu 5 minut HBHA (20 mM HEPES, pH 7,0 a 0,5 mg/mLBSA v HBSS), opláchnutím 1 x PBS a sekvenčně fixovaným 4% paraformaldehydem v PBS po dobu 10 minut. Primární protilátky, které byly použity, byly králičí anti-myc (1:200, Abcam,ab9106, Cambridge, MA, USA) a myší anti-flag (1:100, Sigma Aldrich, F3165) protilátky.

Sekundární protilátky, které byly použity, byly Alexa Fluor 488-konjugované oslí anti-králičí protilátky (1:1000; Invitrogen, A21206) a Alexa Fluor 546-konjugované kozí anti-myší protilátky (1:1000; Invitrogen, A10036) . Jádra byla obarvena 40,6-diamino-2-fenylindolem (DAPI) (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). Všechny snímky byly pořízeny konfokálním mikroskopem Zeiss LSM 880.

4.6. Stažení GST

Fúzní protein GST-DCC byl purifikován pomocí kuliček glutathion-SepharoseTM 4B (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) podle protokolu výrobce.

Přibližně 500 µg buněčného lyzátu z buněk HEK293T transfekovaných uvedenými plazmidy bylo inkubováno s 2–5 µg fúzního proteinu GST-DCC-FN5 v pufru RIPA při 4 °C přes noc. Kuličky Glutathi-one-SepharoseTM 4B byly použity k zachycení fúzního proteinu GST-DCC-FN5 a jeho interagujících proteinů. Navázané proteiny byly uvolněny do proteinového nanášecího pufru tepelnou denaturací.

4.7. Primární kultura kortikálního neuronu

Primární kortikální neurony byly kultivovány, jak bylo popsáno dříve [56]. Stručně řečeno, embrya (E17) byla odebrána z anestetizovaných březích myší. Mozkové kůry byly odděleny a nasekány na malé kousky.

Po inkubaci v {{0}},125% Trypsin Plus s 0,05% DNázou v HBSS při 37 °C po dobu 20 minut byly buňky triturovány ohnivě leštěnými skleněnými Pasteurovými pipetami a přefiltrovány přes 40 um filtr.

Disociované buňky byly suspendovány v DMEM s 10 % FBS a naneseny na misky potažené poly-D-lysinem nebo skleněná krycí sklíčka při 37 °C v atmosféře 5 % CO2. Po 4 hodinách bylo médium nahrazeno neurobazálním médiem doplněným B27 a GlutaMAX.

4.8. Protokoly NLT buněčné kultury a léčby

Myší neuronální buňky exprimující GnRH (NLT) byly udržovány naší laboratoří. Buňky NLT byly pěstovány v DMEM (Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) obsahujícím 10 % FBS (BiologicalIndustries, Kibbutz Beit Haemek, Izrael) a 1 % penicilin/streptomycin (Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA) při 37 ◦C pod zvlhčená atmosféra 95 % vzduchu a 5 % CO2.

Pro stanovení neurotoxicity heminu byly k buňkám NLT přidány různé koncentrace (0, 10, 30, 60, 90 a 120 uM) heminu (Sigma-Aldrich) a ošetřeny po dobu 6 hodin. Z těchto koncentrací bylo vybráno 60 uM (LD50) a použito v následujících experimentech.

Kontrolní skupiny byly ošetřeny pouze vehikulem (DMSO). Životaschopnost buněk a živé/mrtvé barvení byly provedeny 6 hodin po ošetření. Pro každou skupinu byly použity tři jamky. Experimenty byly opakovány alespoň 3krát.

4.9. In vitro model heminem indukované buněčné smrti

Buněčná smrt byla indukována v primárních kortikálních neuronech a buňkách NLT ošetřením 50uM a 60uM heminu, v daném pořadí, jak bylo popsáno dříve [57,58]. Hemin byl rozpuštěn v 0,1 M NaOH za vzniku zásobního roztoku. Pro studie neuroprotekce byly buňky ošetřeny heminem 6h v přítomnosti určených činidel nebo seleničitanu sodného rozpuštěného dvakrát destilovanou vodou.

4.10. CCK-8 test

Životaschopnost buněk byla měřena pomocí testu CCK{0}} (CK04, Dojindo, Kumamoto, Japonsko), jak bylo popsáno dříve [59]. Stručně řečeno, Neuronal byly nasazeny na 96-jamkové destičky v hustotě 6000 buněk/jamku ve 100 ul kultivačního média a přiváděny do inkubátoru přes noc.

Buňky byly ošetřeny Heminem po dobu 6 hodin. Neuronové buňky byly promyty v předehřátém PBS (37 °C) a CCK-8 činidle (10 ul na 100 ul média) v každé jamce.

Poté jsme destičky inkubovali po dobu 2 hodin v atmosféře 5% CO2 a pomocí čtečky mikrodestiček byla měřena absorbance při 450 nm. Životaschopnost buněk byla uvedena jako procento kontroly (neošetřené buňky).

4.11. Živé/mrtvé barvení

Schopnost testu CCK-8 měřit životaschopnost byla ověřena barvením calceinAM/PI v PBS (Live/Dead Assay, KeyGEN BioTECH, Nanjing, Čína) podle pokynů výrobce.

Barvicí roztok sestával z 2 uM kalceinového AM činidla a 8 uM PI činidla smíchaného v PBS. Vzorky byly inkubovány po dobu 30 minut a zobrazeny pomocí 20x objektivu fluorescenčního mikroskopu (Olympus FSX100, Tokio, Japonsko). Pro in vitro model heminem indukované buněčné smrti byly použity minimálně 3 nezávislé buněčné kultury.

4.12. Syntéza a podávání peptidů

Pep Ctrl (NH2-TPCCGKTDVGI-CONH2), Pep E1 (NH2- HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), Pep E2 (NH2- CPCKDGVTGIT-CONH2), Tat (NH{{11} }YGRKKRRQRRR-CONH2),TE1 (NH2- YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), značené FITC TE1 (NH2-YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), EGF3NH(značené{{2-Pep 27}}HPS CNQTTGQ-CONH2) a označené příznakem Pep E2 (NH2- DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGSCPCKDGVTGIT-CONH2) peptidy s 99% čistotou byly zakoupeny společností Shanghai GL Biochem (Shanghai, China) a společností Wuhan Bioyeargene Biosciences (Wuhan, Čína).

For more information:1950477648nn@gmail.com