Nová zánětlivá dendritická buňka, která je hojná a přiléhá k T buňkám v ledvinách pacientů s lupusovou nefritidou
Feb 24, 2022
Mechanismy, které podporují lokální zánětlivé poškození během vzplanutí lupusové nefritidy (LN), jsou z velké části neznámé. Pochopení klíčových imunitních buněk, které řídí intrarenální zánět, posouvá naše znalosti o patogenezi onemocnění a informuje o vývoji nových terapeutik pro léčbu LN. V této studii jsme analyzovaliledvina biopsie od pacientů s proliferativní LN a identifikovaly novou populaci zánětlivých dendritických buněk (infDC), která je vysoce exprimována v LNledvina, ale u zdravého člověka se vyskytuje minimálněledviny.Během agnostického hodnocení exprese imunitního transkriptu vledvinyz pacientů s proliferativní LN byl nejhojněji overexprimovaný transkript z izolovaných glomerulů FCER1G, který kóduje Fc receptorový gama řetězec (FcR ). K identifikaci typů buněk exprimujících FcR, které infifiltrujíledvinav LN byly provedeny studie dneledvinabiopsie od pacientů s aktivní LN pomocí konfokální imunoflfluorescenční (IF) mikroskopie. To ukázalo, že FcR je hojně přítomen v periglomerulární (PG) oblastiledvinaa v menší míře v tubulointersticiu (TI). Další zkoumání povrchových markerů těchto buněk ukázalo, že to byly FcR plus, MHC II plus, CD11c plus, CD163 plus, CD5, DC-SIGN plus, CD64 plus, CD14 plus, CD16 plus, SIRP plus, CD206, CD68, CD123 CD3 a CDllbV, což naznačuje, že buňky byly infDC. Kvantifikace infDC ukázala průměrně 10-násobně vyšší úroveň infDC v LNledvinave srovnání se zdravýmiledviny. Důležité je, že IF identifikoval CD3 plus T buňky jako sousedící s těmito infDC v PG prostoru LNledvina,zatímco oba typy buněk jsou u zdravých přítomny minimálněledvina.Identifikovali jsme tedy dříve nepopsaný DC u lupusuledvinykteré mohou interagovat s intrarenálními T buňkami a hrát roli v patogeneziporanění ledvinpři vzplanutí LN.
klíčová slova:zánětlivé dendritické buňky, lupusová nefritida, ledviny, autoimunita, adaptivní imunitní odpověď, T buňky, SLE
ÚVOD
Lupusová nefritida (LN) je závažnou komplikací systémového lupus erythematodes (SLE), která je spojena se značnou morbiditou a mortalitou. Až 30 procent pacientů s LN progreduje do konečného stadianemoc ledvin(ESKD) (1). Neexistují žádné specifické terapie schválené Úřadem pro potraviny a léčiva Spojených států (FDA) k léčbě LN a současné terapie produkují suboptimální míru odezvy se značnou cytotoxicitou (2). My a další výzkumníci jsme zkoumali molekulární patologiiledvinaběhem aktivní LN k lepšímu pochopení patogenezeporanění ledvinv LN a drahách, které mohou být specificky zaměřeny na léčbu LN.
CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCE LEDVIN/RENÁL
V průběhu agnostického hodnocení exprese transkriptu v laserové mikrodisekciledvinatkáně z klinických biopsií LN jsme zjistili, že nejhojněji nadměrně exprimovaný transkript v glomerulárním kompartmentu byl FCER1G, kódující gama řetězec Fc receptoru (FcR). Předpokládalo se, že tento transkript odráží imunitní buňky infifiltrujícíledvinaběhem aktivní LN a tato práce byla provedena za účelem identifikace buněčných typů reprezentovaných nadměrně exprimovaným FcR. V této studii byly tedy transkriptomické nálezy použity jako vodítko pro studie konfokální imunofluorescence (IF) pro charakterizaci hlavních infifiltrujících imunitních buněk přítomných vledvinapři vzplanutí LN. Identifikovali jsme jedinečnou populaci zánětlivých dendritických buněk exprimujících FcR (infDC), která sídlí v periglomerulárním (PG) prostoru a sousedí s CD3 plus T buňkami, což znamená potenciální křížovou komunikaci mezi populacemi infDC a T buněk.
MATERIÁLY A METODY
Experimentální designÚčelem této práce bylo provést transkripční analýzu a IF onledvinabiopsie provedené na vzplanutí LN k identifikaci hlavních infifiltrujících imunitních buněk přítomných vledvinav době vzplanutí LN. Byla provedena transkriptomická analýzaledvinabiopsie získané při vzplanutí LN od 58 pacientů s proliferativní (třída III/IV ± V) LN v letech 2007 až 2013. Po dokončení klinického testování byly použity archivní biopsie. Byla provedena laserová záchytná mikrodisekce (LCM) a odděleně byly izolovány glomeruly a tubulointerstitium (TI). Preimplantační žijící dárceledvinabiopsie (n=10) sloužily jako zdravé kontroly (HC) a byly analyzovány paralelně s biopsiemi LN. Stejný nefrolog (AM) léčil všechny pacienty a jeden zkušený nefropatolog (VA) četlledvinabiopsie. Etická rada nemocnice Fernandez (Buenos Aires) a institucionální kontrolní komise The Ohio State University schválily vyšetřováníledvinabiopsie.
Extrakce a analýza RNA
Biopsie použité pro transkriptomickou analýzu byly fixovány ve formalínu a zalité v parafínu (FFPE). Z parafinových bloků byly z každé biopsie nařezány 10um řezy. Po deparafinizaci byly všechny dostupné glomeruly a TI odděleny laserovou mikrodisekcí (PALM MicroBeam, Zeiss Labs, Bernried, Německo), zachyceny a štěpeny proteinázou K. DNA byla odstraněna DNázou. RNA byla vysrážena, extrahována pomocí rotačních kolon RNeasy MinElute (Qiagen, Redwood City, CA, USA) a eluována ve vodě bez RNázy. Exprese transkriptu byla analyzována z 250 ng extrahované RNA pomocí platformy NanoString nCounter a panelu transkriptů lidské imunologie GX [NanoString Technologies, Seattle, WA, USA; (3–5)]. Lidský imunologický panel v2 sestával z 579 genů imunitní odpovědi, 6 pozitivních kontrolních genů a 6 negativních kontrolních genů. Kompletní seznam těchto genů lze nalézt v dřívější publikaci z naší skupiny (6). Pro konfokální IF mikroskopii, zmrazenéledvinabioptické tkáně od čtyř pacientů s aktivní LN třídy IV byly získány z Ohio State Nephropathology Biorepository. Jako HC byly použity tři vzorky zmrazené nefrektomie. Nefrektomie byly provedeny u pacientů sledvinovébuněčný karcinom. Tkáň získaná pro analýzu byla oddělena od rakovinné tkáně. Okolní tkáň použitá pro analýzu se histologickou analýzou zdála zdravá. Nefrektomie byly použity jako kontroly, protože byly potřeba zmrazené vzorky a v našem bioúložišti jsme neměli zmrazenou transplantovanou dárcovskou tkáň.
Protilátky
Primární protilátky (Abs) použité pro IF jsou všechny uvedeny v doplňkové tabulce 1. Protilátky použité v této studii byly validovány pro IF buď pomocí lidských lymfatických uzlin, nebo pomocí lidských jater jako pozitivní kontroly (data nejsou uvedena). Použité izotypové kontroly jsou ChromoPure normální králičí IgG, normální myší IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA), myší IgG1K (BioLegend, San Diego, CA, USA) a myší IgG2bK (Jackson ImmunoResearch). Sekundární protilátky použité pro IF byly kozí F(ab′)2 anti-myší IgG 488 (Jackson ImmunoResearch) a kozí anti-králičí IgG 568, kozí anti-králičí IgG 488 a kozí anti-králičí IgG 647 od Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).
CISTANCHE ZLEPŠÍ ONEMOCNĚNÍ LEDVIN/RENÁL
ImunoflfluorescenceZmrazená nefrektomie a LNledvinabiopsie byly nařezány (5 um řez na sklíčko), fixovány ve 4% fyziologickém roztoku pufrovaném paraformaldehydem (PBS) po dobu 15 minut při teplotě místnosti a promyty PBS (s 0,02 procenta azidu sodného). Řezy byly blokovány 5% mlékem v PBS, následovala inkubace s primární Ab přes noc. Po třech promytích PBS po dobu 1 hodiny byly řezy inkubovány s fluorescenčně značenými sekundárními Abs po dobu další hodiny při teplotě místnosti a jádra byla obarvena DAPI (100 ng/ml) po dobu 10 minut. Řezy byly poté připevněny pomocí Prolong Gold (Invitrogen) pod krycí sklíčka. Kontrolní Abs odkazují na seznam izotypových Ab s jejich příslušnými sekundárními Ab. Obrázky byly získány pomocí laserového skenovacího konfokálního mikroskopu Olympus FluoView 1000 vybaveného (Olympus Corp., Tokio, Japonsko) spektrálním detekčním systémem pro jemnější separaci flfluorochromů (spektra FV1000) spolu s x60 olejovou imerzní čočkou při pokojové teplotě.
Kvantitativní mikroskopieÚroveň exprese infDC v LN a HCledvinybyla kvantifikována z obrázků, které byly obarveny na infDC s použitím anti CD163. Celková intenzita CD163 na základě exprese infDC byla vypočtena pomocí softwaru ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Intenzita CD163 byla získána po odečtení fluorescence pozadí od izotypu plus sekundárních snímků obarvených Ab a měřením plochy a průměrné intenzity fluorescence zelených pixelů pocházejících z infDC s použitím protilátky CD163, jak bylo popsáno dříve (7).
Statistická analýzaPro transkriptomickou analýzu jsou popisné statistiky prezentovány jako průměr ± standardní odchylka nebo jako procento. Pro klinické proměnné byly podle potřeby použity t-testy, ANOVA nebo Wilcoxonův rank sum test. Pro kategorické klinické proměnné byl použit Fisherův exaktní test. Pro nanostringová data byly surové počty normalizovány na pozitivní kontroly s spike-in a poté transformovány log2. Aby se snížilo technické zkreslení, byly odfiltrovány geny s hladinou exprese pod průměrem plus dvě standardní odchylky negativních kontrol. Kvantilní normalizace byla aplikována na zbývající transkripty (522 pro glomeruly a 502 pro TI). Glomerulární vzorky byly analyzovány odděleně od vzorků TI. Pro stanovení diferenciální exprese, glomerulární a TI transkriptové exprese z LNledvinybyly porovnány s kontrolami. A 1.5-násobná změna a p < 0.05="" byly="" nezbytné="" k="" tomu,="" aby="" byl="" přepis="" považován="" za="" diferenciálně="" vyjádřený.="" pro="" statistickou="" analýzu="" konfokální="" mikroskopie="" byl="" použit="" dvoustranný="" studentův="" t-test="" pro="" srovnání="" dvou="" skupin="" a="" p="">< 0,05="" bylo="" považováno="" za="" významné.="" všechny="" analýzy="" byly="" provedeny="" pomocí="" origin="" pro="" verze="" 2020="" (originlab="" corp.,="" northampton,="" ma,="">
VÝSLEDEK
Transkriptomická analýza biopsií ledvin při vzplanutí LN odhaluje významnou nadměrnou expresi FCER1G v glomerulech a TI při vzplanutí LNProvedli jsme transkriptomickou analýzu RNA izolované z glomerulů a TI pomocí LCM zledvinabiopsie získané při proliferativním vzplanutí LN (n=58). Preimplantační žijící dárcetransplantace ledvinbiopsie byly použity jako HC (n {{0}}). Transkriptomická analýza pro 579 imunitních transkriptů ukázala, že FCER1G je nejvýznamněji nadměrně exprimovaný glomerulární transkript [Složitá změna (FC): 3,6, p-hodnota (p): 1E-10], ale byl také významně nadměrně exprimován v TI (FC: 1,7, p=0,001) při vzplanutí LN (obrázek 1 a doplňková tabulka 2) ve srovnání s HC. Kromě toho exprese FCER1G korelovala s indexem aktivity histologického onemocnění NIH (r=−0,43, p=0,01).
FcR ledvin je vysoce exprimován při vzplanutí LN a je omezen na periglomerulární oblastAbychom charakterizovali imunitní buňku, která exprimuje FCER1G, analyzovali jsme protein kódovaný FCER1G, gama řetězec receptoru Fc [FcR; (8)] v lidské LN a HCledvinatkáně pomocí IF mikroskopické analýzy za použití specifické protilátky. Analýza IF odhalila, že FcR je minimálně exprimován v glomerulech (identifikován podocytovým markerem, synaptopodinem), ale hojně exprimován v PG a TI oblastech biopsií LN flflare. Zdá se, že buňky exprimující FcR mají typický vzhled buněčného infifiltrátu v oblasti PG mikroskopicky (obrázek 2). IF analýza prokázala, že během LN flflare je oblast PG rozšířena v důsledku přítomnosti buněčného infifiltrátu, zatímco oblast PG je tenká a bez buněčné infifiltrace v HC, jak je vidět na sloučených snímcích na obrázku 2
a doplňkový obrázek 4. Nejdůležitější je, že jsme viděli slabou až nulovou expresi FcR v LN a HC s použitím izotypových protilátkových kontrol, které byly zpracovány současně (data nejsou uvedena). Tato data podporují transkriptomická zjištění, že FCER1G kóduje FcR a je hojně nadměrně exprimován v proliferativním vzplanutí LN.
Makrofágové markery CD11b a CD68 se nekolokizovaly s FcR v lidské LN ledvině
Na základě předchozích popisů intersticiálních leukocytů v LN (9–11) jsme předpověděli, že buňka exprimující FcR je makrofág. Duálně jsme obarvili bioptické řezy s anti-FcR protilátkami FcR protilátkami proti makrofágovým markerům CD68, CD206 a CD11b. Neočekávaně, barvení na M2-specifické makrofágové markery, CD11b a CD206 [(12); data neuvedena], vykazovala slabou až nulovou expresi v LNledvina.Mezitím panmakrofágový marker CD68 (13) vykazoval glomerulární expresi; což naznačuje, že makrofágy M1 byly nalezeny primárně v glomerulech. Nicméně barvení CD68 se neshodovalo s barvením PG a TI pro FcR (obrázek 3). Tato data ukazují, že buňky exprimující FcR vledvinanejsou makrofágy. Ačkoli protilátky proti CD206, CD68 a CD11b poskytly slabý nebo žádný signál v LNledvina, silně obarvili Kupfffferovy buňky ve zdravých lidských játrech, což potvrdilo spolehlivost a specifičnost protilátek [(14); údaje nejsou uvedeny].
FcR kolokalizovaný s konvenčním markerem dendritických buněk CD11c a MHCII v ledvinách LN
K určení, zda buňka exprimující FcR byla dendritická buňka (DC), byla provedena tříbarevná IF mikroskopie s použitím konvenčního DC markeru CD11c a MHCII, o kterém je známo, že je vysoce exprimován ve všech lidských DC (15, 16). ostatní myeloidní buňky. Kvalitativní analýza prokázala, že exprese FcR (značená pomocí anti-FcR protilátky následované sekundární protilátkou konjugovanou s Alexa-594 barvivem (Invitrogen), která vykazovala červenou emisní barvu v konfokální mikroskopii) byla kolokalizována jak s CD11c, tak s MHCII. CD11c/MHCII byly značeny pomocí protilátky CD11c/MHC II následované sekundární protilátkou konjugovanou s barvivem Alexa-488 (Invitrogen), která vykazovala zelenou emisní barvu v konfokální mikroskopii (obrázek 4). Kolokalizace vedla ke žluté barvě odrážející přítomnost jak flfluorescujícího FcR (červená), tak CD11c/MHCII (zelená), které se společně vyskytovaly ve stejném místě/buňce v rozměru XY (obrázek 4). Vzor barvení CD11c odpovídal FcR (obrázek 4) v oblasti PG a TI a žádná protilátka se nebarvila v glomerulech. V souladu s CD11c se MHCII (obrázek 4, spodní řada) také silně barvil v PG, kolokalizoval se s FcR. Ale, kromě silného PG barvení, MHCII také vykazoval slabé barvení v glomerulu, což naznačuje přítomnost slabé glomerulární buňky exprimující MHCII, která může být myeloidní buňka.
FcR nebyl kolokalizován s markerem plazmocytoidních dendritických buněk CD123, ale kolokalizoval se s markerem dendritických buněk odvozeným z monocytů DC-SIGN
K identifikaci, která podskupina DC exprimujících FcR se nachází v oblasti PG během vzplanutí LN, byla bioptická tkáň obarvena na CD123, což je specifický marker plazmacytoidních DC (pDC) (16, 17). Buňky CD123 plus byly nalezeny v oblasti TI (obrázek 5, horní řada), ale chyběly v glomerulech a v oblasti PG LNledviny. Buňky CD123 plus byly řídké a barvení CD123 v TI nebylo v souladu s barvením FcR. To naznačuje, že intrarenální DC exprimující FcR v LN není pDC. Exprese signálního regulačního proteinu alfa (SIRP) kolokalizovaná s FcR (obrázek 5, prostřední řada), což naznačuje, že PG DC nejsou myeloidní konvenční DC typu 1 (cDC1) (16). Zbývající možnosti byly, že PG DC jsou myeloidní konvenční DC typu 2 (cDC2) nebo DC odvozené od monocytů (moDC). Pro rozlišení mezi těmito podskupinami DC byla hodnocena exprese DC-SIGN, marker specifický pro moDC. DC-SIGN kolokalizovaný s FcR v oblasti PG (obrázek 5, spodní panel), což naznačuje, že PG DC je moDC.
FcR kolokalizovaný s CD64, CD16 a CD14 v periglomerulární oblasti ledvin a potvrdil, že DC
Nalezeno v LNledvinyat Flare jsou moDC Aby se potvrdilo, že DC exprimující FcR jsou moDC, byly dále charakterizovány vyhodnocením přítomnosti dalších markerů buněčného povrchu, o kterých je známo, že jsou přítomny na moDC, včetně CD64, CD16 a CD14. Každý z těchto markerů byl nalezen v LNledvinatkáně a kolokalizovány s FcR (doplňkový obrázek 1).
FcR kolokalizovaný s dříve identifikovaným cirkulujícím markerem infDC Exprese CD163 a CD163 je nadměrně exprimována při vzplanutí LN
Následně byla provedena kolokalizační analýza CD163 s FcR, aby se určilo, zda zde pozorovaná moDC populace může být nedávno popsaná cirkulující infDC (18). Obrázek 6 potvrzuje kolokalizaci CD163 (zelená) s FcR (červená) v oblasti PG (obrázek 6A) a TI (obrázek 6B), což silně naznačuje, že podskupina moDC přítomná vledvinaběhem LN flflare jsou skutečně infDC. Protože infDC neexprimují CD5 (18),ledvinatkáň byla obarvena na CD5. Přestože buňky exprimující CD5-byly přítomny vledvinanebyly umístěny v blízkosti oblasti PG a nelokalizovaly se s FcR (doplňkový obrázek 2), což naznačuje, že tyto infDC postrádají expresi CD5. Kvantifikovat rozdíl v infDC v LN a HCledvinyinfDC byly kvantifikovány měřením oblasti exprese CD163 po obarvení monoklonální protilátkou anti-CD163 a střední intenzity fluorescence CD163. Použití 16 glomerulárních snímků ze 4 vzplanutí LNledvinya 18 glomerulárních snímků ze tří HCledvinyzjistili jsme 9- až 21-násobně vyšší hladinu infDC v ledvinách LN ve srovnání s HC (obrázek 6C). Protože se již dříve ukázalo, že infDC exprimují CD11b (19, 20), dále jsme analyzovali lidské LNledvinas potkaní anti-lidskou CD11b mAb (klon M1/70) spolu s anti-CD163 protilátkou. V souladu s předchozími zjištěními v tomto rukopisu (obrázek 3), klon M1/70 poskytl slabý až nulový signál v infDC (doplňkový obrázek 3).
Zánětlivé dendritické buňky byly přítomny v těsné blízkosti s T buňkami při vzplanutí LN
Lupusová nefritidaledvinařezy byly označeny T lymfocytárním markerem CD3 a protilátkami proti FcR a CD163 pro prostorovou lokalizaci T lymfocytů a infDC. Značení CD3 pomocí markerů infDC bylo provedeno dvěma způsoby za použití dvou různých klonů protilátek anti-CD3 (myší mAb UCHT1 a králičí mAb SP7) a 2 markerů infDC. CD3 mAb UCHT1 a anti-FcR barvení ukázalo přítomnost CD3 plus T buněk přítomných v sousedství FcR plus infDC v PG oblasti LNledvina(Obrázek 7A). Barvení anti-CD163 plus CD3 mAb SP7 (obrázek 7B) potvrdilo, že infDC byly přítomny v těsné blízkosti CD3 plus T buněk v lidské LNledvina.I když barvení CD3 pomocí markerů infDC ukázalo hlavně diskrétní zelené a červené barvení pro oba typy buněk, na několika místech se červené a zelené barvení překrývalo.
DISKUSE V této studii jsme identifikovali novou infDC populaci infiltrující doledvinana vzplanutí LN. Tyto infDC infiltrují, lokalizují se do PG a TI prostorů a jejich exprese byla 10-krát větší v LN vzplanutíledvinave srovnání s HC. Důkaz, že jsou nové, je založen na jejich povrchových markerech, kterými jsou FcR plus , MHCII plus , CD11c plus , CD163 plus , CD5 , DC-SIGN plus , CD64 plus , CD14 plus , CD16 plus , SIRP plus , CD206 , CD68 , CD123 , CD3 a CD11bV . Je pozoruhodné, že tyto infDC byly přítomny v těsné blízkosti k T buňkám v oblasti PGledvinapři erupci LN. Pozorování z tohoto výzkumu jsou podpořena předchozími studiemi, které detekovaly infiltraci PG DC v různých myších modelech experimentální glomerulonefritidy (21, 22). Není však jasné, proč se infDC usazují v prostoru PG. Předchozí literatura naznačuje, želedvinovéDC začíná v glomerulu a přechází z mezangia přes glomerulární chomáče a lymfatické uzliny do drenážních lymfatických uzlin za účelem prezentace antigenu T buňkám v PG (23). V tomto případě jeledvinovéDC mohou začít v glomerulu, ale v době, kdy se LN stane klinicky evidentní, se tyto DC již přesunuly z glomerulu a usadily se v PG prostoru. Poté se mohou uvolnit inhibiční signály a blokovat cytokin/chemokiny potřebné pro diferenciaci monocytů na infDC, což vysvětluje nepřítomnost infDC z glomerulů LN v době biopsie. Alternativně je možné, že se DC chemotaktické faktory uvolňují přímo zledvinovétubulární buňky přitahující infiltrující DC (24). Domníváme se, že k oběma dochází v reakci na zánětlivé podněty vedoucí k PG a TI akumulaci infDC během LN.
Toto šetření prokázalo, že PG DC nejsou plazmacytoidní nebo konvenční DC. Exprese monocytových markerů CD14, CD64 a CD16, které byly popsány dříve, potvrdila, že tyto PG DC představují moDC (16, 25, 26). V případě aktivního zánětu nebo infekce se moDC označují jako infDC (27). Další charakterizace těchto moDC odhalila jedinečnou populaci infDC, která nebyla dříve popsána v lidské LN. Pozoruhodně však nedávná transkriptomická studie imunitních buněk periferní krve u pacientů se SLE identifikovala signaturu infDC, která byla CD163 plus, CD14 plus a CD5h, což je podobné intrarenální populaci infDC, která je zde uváděna (18). Nedávno bylo provedeno rozsáhlé hodnocení imunitních buněk pomocí jednobuněčné RNA-Seq zledvinabiopsie na vzplanutí LN (28). V této studii bylo identifikováno několik monocytových klastrů s jedním monocytovým klastrem exprimujícím CD163 plus, CD14 plus, CD16 plus, CD64 plus a DC-SIGN plus podpis, podobný zde popsanému infDC. Dále se mělo za to, že charakterizovaná monocytová linie je infiltrující podskupinou monocytů, protože byla minimálně exprimována u zdravýchledviny. Zatímco tyto IF studie neposkytují přesné měření úrovně exprese markerů linie, a to by mohlo umožnit identifikaci přechodných stádií konverze monocytů na DC dDFOult, tato zjištění umožňují charakterizaci a prostorovou orientaci pro další kvantitativní studie.
Tato nová populace infDC se také podobá dříve hlášené infDC z lymfatických uzlin myší infikovaných bakterií Listeria (CD64 plus CD11c plus MHCII plus) (27) a střevní sliznice u celiakie (29). InfDC byly také dříve popsány v lidské artritické synoviální tekutině od pacientů s revmatoidní artritidou (20). Nicméně infDC popsaný v LNledvinališí se od synoviální tekutiny infDC; v tom, že jim chybí makrofágové markery CD11b a CD206, které jsou přítomné na synoviální tekutině infDC. To naznačuje, že zde popsaná populace infDC se liší od populace infDC pozorované alespoň u některých jiných autoimunitních onemocnění a může být jedinečná proledvinapři vzplanutí LN. Navíc dřívější studie identifikovaly FcεRI [(19, 30); identifikované pomocí protilátky antiFcεRI (eBioscience, Inc., San Diego, CA, USA) pro vazebné místo protilátky] jako nejlepší marker pro rozlišení infDC
OBRÁZEK 6|Gama řetězec Fc receptoru se kolokalizuje s dříve identifikovaným markerem cirkulujících zánětlivých dendritických buněk (infDC) CD163 a exprese CD163 je nadměrně exprimována v lidských LN ve srovnání s HC. (A) Tři barevné IF snímky, které jsou reprezentativní pro 3 lidské LNledvinyukazující kolokalizaci CD163 zeleně OBRÁZEK 6|(první) s FcR červeně (uprostřed) v oblasti PG. Druhý řádek zobrazuje zvětšenou část obrázků horní řady zvýrazněných v tečkovaném čtverci. Třetí sloupec ukazuje sloučení prvních 2 spolu s DIC a DAPI barvením jader (modrá). (B) Tři barevné IF snímky, které jsou reprezentativní pro 3 lidské LNledvinyukazující kolokalizaci CD163 zeleně (první) s FcR červeně (uprostřed) v tubulointersticiální (TI) oblasti. (C) Sloupcový graf zobrazuje kvantifikaci infDC na základě exprese CD163 pomocí zelené barvy z barvení anti-CD163 z 18 G snímků 3 různých HC a 16 snímků glomerulů ze 4 různých vzorků LN pomocí softwaru ImageJ. Samotná plocha (graf vlevo) a plocha × průměrná intenzita fluorescence (graf vlevo) CD163 (zelená) byly změřeny a vyneseny do grafu s průměrem ± SD. Data byla analyzována nepárovým t-testem (jednostranný) za použití každého měření a p-hodnoty byly uvedeny ve sloupcovém grafu. OBRÁZEK 7|řádek zobrazuje 3 barevné obrázky IF, které představují tři různé LNledvinyukazující přítomnost CD3 (pan T buněčný marker červeně) sousedící s CD163 (infDC marker zeleně), které jsou vysoce zvětšené od PG oblasti. Spodní řádek ukazuje sloučené obrázky prvních 2 sloupců vpravo a sloučené obrázky prvních 2 sloupců plus DIC a DAPI barvení jader (modře) vlevo. z makrofágů a cDC pomocí průtokové cytometrie. Naše studie naznačují, že FcR , cytoplazmatická gama podjednotka, jejímž prostřednictvím funguje více FcR, včetně FcεRI, Fc RI, Fc RIIIa a Fc RI, stejně jako další imunitní receptory jako GPVI, OSCAR a TREM (8), jsou spolehlivé marker pro IF studie na vzorcích biopsie pacientů. Je pravděpodobné, že infDC v LNledvinaexprimují FcεRI, podobně jako FcRI a Fc Rllla (doplňkový obrázek 1), protože přítomnost FcR nepřímo naznačuje přítomnost více receptorů včetně FceRI.
CISTANCHE ZLEPŠÍ ONEMOCNĚNÍ LEDVIN/RENÁL
Důležitost charakterizace intrarenálního buněčného typu exprimujícího CD163 je zvýšena nedávnými nálezy z naší skupiny, které odhalují, že hladiny CD163 v moči byly významně vyšší u aktivní LN ve srovnání s extrarenálním SLE nebo neaktivním SLE (31). CD163 v moči koreloval se závažností onemocnění a indexem histologické aktivity. Zatímco studie Mejia et al (31). navrhl, že CD163 pochází z makrofágů M2, nyní navrhujeme, aby močový CD163 také pocházel z infDC, což podporuje myšlenku, že CD163 v moči je biomarker, který odráží aktivitu onemocnění v LN.
Pokud jde o původ těchto infDC, exprese monocytových markerů naznačuje, že infDC mohou být odlišeny od infiltrovaných monocytů vledvinapři zánětu způsobeném různými autoimunitními podněty včetně imunitních komplexů. Na druhé straně přítomnost CD163 plus CD14 plus infDC u pacientů s cirkulací lupusu (18) naznačuje, že infDC z periferní cirkulace vstupují doledvinav LN. Je také možné, že oba mechanismy odpovídajíledvinovéinfDC. Mechanismy, kterými infDC interagují s T buňkami během lidské LN, nejsou v současnosti známy. Ačkoli barvení CD3 spolu s markery infDC ukazuje hlavně diskrétní populace obou typů buněk v těsné blízkosti (obrázek 7B), existují také důkazy o určitém překrývání, které naznačuje tvorbu imunologické synapse a interakce mezi těmito infDC a T buňkami v LN.ledvina.T buňky jsou však připraveny migrovat do sekundárních lymfoidních orgánů; nedávná zpráva ukázala přítomnost imunitních agregátů organizovaných jako terciární lymfoidní struktury (TLS) u pacientů s LN a myší LNledvinykteré připomínají lymfatické uzliny genovými podpisy a složením buněk (32). To je v souladu s předchozí zprávou, která identifikovala germinální centra s agregáty T- a B-buněk v LNledvina(33). Zvažování těchto zjištění v kontextu identifikace infDC v LNledvinanaznačuje, že infDC v PG a TI mohou být důležitými hybateli lokální adaptivní imunitní odpovědi v ledvinách LN. I když ještě není jasné, zda jsou tyto T buňky rezidentními T buňkami nebo primárně aktivovanými T buňkami, je známo, že infDC za různých chorobných podmínek mají schopnost spustit vývoj hlavních podskupin pomocných T buněk, jmenovitě Th1, Th2 a Th17 (20 , 34, 35). Ačkoli studie in vitro naznačují, že infDC se podílejí na iniciaci a udržování Th17 odpovědi (19), další studie o novém LNledvina infDC jsou potřebné, protože zánětlivý stimul a tkáňové mikroprostředí určují funkci infDC in situ (36).
ZÁVĚR
Na závěr jsme identifikovali novou populaci infDC, která nebyla dříve popsána v LNledvina.Tyto infDC sídlí v oblasti PG a sousedí s infiltrujícími T buňkami. Naše zjištění spolu s nedávnou literaturou identifikující cirkulující CD163 plus infDC v SLE a CD163 v moči jako cenný marker aktivity onemocnění u LN naznačují, že infDC a jejich partneři T lymfocytů mohou být klíčovými přispěvateli k řízení lokální adaptivní imunitní reakce během aktivní LN. Další studie je nezbytná k definování podskupin T buněk sídlících vedle infDC a pochopení mechanismů, kterými PG infDC komunikují s T buňkami, aby řídily lokální zánět v LN.