Nová homozygotní mutace KLHL3 jako příčina autozomálně recesivního pseudohypoaldosteronismu typu II diagnostikovaného pozdě v životě
Nov 02, 2023
Abstraktní úvod:
Pseudohypoaldosteronismus typu II (PHA II) je mendelovská porucha, vyznačující se hyperkalemickou acidózou a nízkými hladinami plazmatického reninu, typicky spojenými s hypertenzí. Mutace ve WNK1, WNK4, CUL3 a KLHL3 způsobují PHA II, s dominantními mutacemi ve WNK1, WNK4 a CUL3 a buď dominantními nebo recesivními mutacemi v KLHL3. Bylo hlášeno čtrnáct rodin s recesivními mutacemi KLHL3 s diagnózou ve věku od 3 měsíců do 56 let, typicky u jedinců s normální funkcí ledvin.
Metody: Provedli jsme klinická a genetická vyšetření u pacienta s hyperkalemickou hypertenzí a použili jsme simulace molekulární dynamiky, heterologní expresi v buňkách COS7 a Western blotting ke zkoumání vlivu mutace kandidátní choroby KLHL3 na expresi proteinu WNK4.
KLIKNĚTE ZDE A ZÍSKEJTE BYLINNOU FORMULACI CISTANCHE PRO LEDVINY
Výsledky: Pacientka, 58-letá žena z příbuzenské rodiny, vykazovala hypertenzi, přetrvávající hyperkalemickou acidózu spojenou se silnou bolestí svalů, nefrolitiázou, chronickým onemocněním ledvin (CKD) a ischemickou chorobou srdeční. Terapie hydrochlorothiazidem korigovala hyperkalémii, hypertenzi a bolesti svalů. Genetická analýza odhalila homozygotní mutaci p.Arg431Trp ve vysoce konzervované poloze KLHL3. Simulace naznačovaly sníženou stabilitu mutantního proteinu, což bylo potvrzeno Western blotem. Ve srovnání s divokým typem KLHL3 vedla kotransfekce p.Arg- 431Trp KLHL3 ke zvýšeným hladinám proteinu WNK4, u kterých se předpokládá, že způsobuje zvýšenou reabsorpci NaCl prostřednictvím thiazid-senzitivního nosiče a PHA II.
Závěry: I u pacientů s pozdním věkem a s přítomností CKD by mělo být podezření na PHA II, pokud jsou hladiny reninu nízké a hyperkalemická acidóza a hypertenze jsou pro stadium CKD neadekvátní, zvláště v přítomnosti podezřelé rodinné anamnézy.
Úvod
Systémová arteriální hypertenze postihuje celosvětově více než 1,1 miliardy dospělých [1] a je celosvětově považována za nejvýznamnější ovlivnitelný rizikový faktor pro morbiditu a mortalitu ze všech příčin [2]. Přibližně 90 % dospělých pacientů má tzv. primární nebo esenciální hypertenzi s multifaktoriální etiologií gen-prostředí [2], zatímco u zbytku lze identifikovat základní příčinu hypertenze. Běžnými příčinami sekundární hypertenze jsou primární aldosteronismus, obstrukční spánková apnoe, parenchymální onemocnění ledvin a stenóza renální arterie [3]. Ve vzácných případech je hypertenze zděděna jako monogenní vlastnost. Postižení pacienti mají typicky nízké hladiny reninu v plazmě, zatímco hladiny aldosteronu a elektrolytů se liší v závislosti na základní etiologii [4]. Mendelovské formy hypertenze se často manifestují v dětství nebo mládí. Dospělí jsou zřídka vyšetřováni na monogenní hypertenzi; jeho prevalence v obecné populaci tedy zůstává neznámá. Ve vybrané kohortě (kritéria pro zařazení alespoň jedno z: věk na počátku 35 let nebo rovný, rezistentní hypertenze, hypertenze s elektrolytovými abnormalitami, hormonální abnormality, abnormální výsledky zobrazování nebo sugestivní klinické příznaky) bylo vyšetřeno 37 kandidátních genů, a patogenní nebo pravděpodobné patogenní varianty byly identifikovány ve 33 z 1 179 případů (2,8 %) [5].
Tato studie se zaměřuje na pseudohypoaldosteronismus typu II (PHA II), formu mendelovské hypertenze, která se vyznačuje hyperkalemickou acidózou a nízkou hladinou plazmatického reninu [6]. PHA II je také známá jako familiární hyperkalemická hypertenze. Poprvé byl popsán v roce 1964 Paverem a Pauline u mladého muže s těžkou hypertenzí a hyperkalémií navzdory jinak normální renální funkci [7], který byl dále charakterizován Stokesem a kolegy [8] a Arnoldem a Healyem [9] a byl prokázán nízký plazmatický renin. Po zprávě o 10-leté dívce s malým vzrůstem, hypertenzí, těžkou hyperkalémií, mírnou acidémií, periodickou paralýzou a potlačeným reninem v roce 1970 Gordonem a kol. [10], syndrom byl také občas označován jako Gordonův syndrom.
V roce 2001 byly jako příčiny PHA II identifikovány mutace v genech serin-threonin kinázy bez lysinu (WNK) WNK1 a WNK4 a další mutace v KLHL3 (kódující kelch-like 3) a CUL3 (kódující cullin 3) geny byly popsány v roce 2012 [12, 13]. Podformy PHA II způsobené mutacemi ve WNK1, WNK4 a CUL3 jsou autozomálně dominantní poruchy, zatímco mutace KLHL3 mohou být zděděny buď autozomálně dominantně, nebo autozomálně recesivním způsobem [12]. KLHL3 se vyznačuje N-terminální doménou BTB, následovanou doménou BACK a strukturou C-terminální šestilisté vrtule sestávající z tzv. Kelchových repetic (zobrazeno na obr. 1d, 2a). Dominantní mutace KLHL3 se shlukují v listech vrtule nebo mezi nimi, zatímco recesivní mutace jsou distribuovány po celém proteinu [12]. Recesivní případy jsou méně časté než případy dominantní; celkem bylo publikováno 21 pacientů ze 14 rodin s recesivní mutací KLHL3 [12–15] (tab. 1).
Základní patofyziologií hypertenze u PHA II je zvýšená reabsorpce NaCl přes thiazid-senzitivní nosič (Kotransportér Na-Cl, NCCT) v distálním stočeném tubulu ledviny a terapie thiazidy koriguje jak hypertenzi, tak elektrolytové abnormality u pacientů s PHA II [16]. Stručně řečeno, WNK1 a WNK4 fosforylují OSR1 (gen 1 citlivý na oxidativní stres) a SPAK (Ste20-related prolin-alanin-rich kinase), které pak fosforylují a aktivují NCCT [17, 18]. KLHL3 je substrátový adaptér ubikvitin ligázy CUL3; komplex KLHL3-CUL3 ubikvitinyluje WNK kinázy a tím podporuje jejich degradaci [19]. Ztráta funkce ubikvitin ligázy nebo porucha vazby na WNK kinázy způsobuje zvýšenou abundanci WNK, zvýšenou fosforylaci NCCT [18] a zvýšenou absorpci NaCl v distálním stočeném tubulu. V pozdějších segmentech nefronu je snížena reabsorpce NaCl přes ENaC (epiteliální sodíkový kanál) a sekrece K+ přes ROMK (renální zevní medulární draslíkový kanál) [20, 21]. KLHL3 knockout myši vykazují hypoplazii distálního stočeného tubulu, silně zvýšené hladiny WNK1 a WNK4 a zvýšenou fosforylaci OSR1, SPAK a NCC v ledvinách. Dále vykazují hyperkalémii, hyperchlorémii a metabolickou acidózu [22]. Zde uvádíme pacienta s autozomálně recesivní PHA II a charakterizujeme základní genetickou mutaci a patofyziologii
Materiály a metody
Příprava DNA a Sangerovo sekvenování DNA byla připravena ze vzorku periferní žilní krve pomocí soupravy QIAamp DNA Blood Maxi Kit (Qiagen) podle pokynů výrobce. Standardní PCR a přímé obousměrné Sangerovo sekvenování genomové DNA byly provedeny s použitím publikovaných primerů pro KLHL3 [13], WNK1 a WNK4 [11] a CUL3_9F (5′-AGGAGACACTTTCTCAAACCG-3′) a CUL3_9R (5′-TGTTCTTCTCCAAAACAATCTACC-3′) primery pro CUL3. Sangerovo sekvenování bylo provedeno v Eurofins Genomics.
Sekvenční zarovnání
Homologní proteinové sekvence byly identifikovány pomocí NCBI Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) a databáze eggNOG (http://eggnogdb.embl.de). Zobrazené sekvence zahrnují lidský KLHL3 a jeho ortology: Homo sapiens (NP_059111.2), Mus musculus (NP_001349344.2), Gallus gallus (XP_015149442.1), Danio rerio (XP_021328460.1), Ciona intestinalis (XP_009862126.1), Drosophila melanogaster (NP_724095.1) a Caenorhabditis elegans (NP_001254310.1) . Lidské paralogy byly identifikovány výzkumem literatury a zahrnují KLHL1 až KLHL42, jak je uvedeno v online doplňkové tabulce 1 (všechny online doplňkové materiály viz www.karger.com/doi/10.1159/000521626) [23]. Sekvence byly zarovnány pomocí Jalview verze 2.10.5 [24]. Struktura domény byla od UniProt (Q9UH77, přístupná 13. dubna 2021) a byla vizualizována pomocí DOG [25].
Plazmidy a místně řízená mutageneze
Plazmidy pTRE2hyg WNK4 a pFN21A KLHL3 byly laskavým darem Dr. Shinichi Uchida (Tokyo Medical and Dental University). Pro zavedení mutace p.R431W byly primery navrženy pomocí Primer X (https://www.bioinformatics.org/primerx): 5′- GATGAACACGCGGTGGAGCAGTGTGG -3′ (KLHL3_ R431W{{10} }F) a 5′- CCACACTGCTCCACCGCGTGTTCATC -3′ (KLHL3_R431W_1R). Mutantní zbytky jsou zobrazeny tučně. Místně řízená mutageneze byla provedena pomocí QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit s PfuUltra High-Fidelity DNA polymerázou (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) podle pokynů výrobce. cDNA byla sekvenována podle Sangera v Eurofins Genomics. Plazmidy byly připraveny pomocí soupravy QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit.
Tkáňová kultura, přechodná transfekce a Western blot
COS7 buňky byly kultivovány v DMEM + L-glutamin, 10% FBS a 1% penicilin/streptomycin (vše Gibco, Thermo Fisher). Pro transfekce byly buňky nasazeny na 6-jamkové destičky v hustotě 1,9 x 10}5 buněk/jamku a pěstovány do přibližně 90% hustoty. Buňky byly transfekovány 1 ug pTRE2hyg WNK4 a 2 ug pFN21A (prázdný vektor nebo KLHL3 divokého typu [WT]) nebo KLHL3 R431W cDNA s použitím Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) podle pokynů výrobce. Pro transfekci byly použity dva nezávislé klony. Čtyřicet osm hodin po transfekci byly buňky promyty studeným PBS a lyžovány v 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA a 1 % NP40 obsahujícím kompletní koktejl inhibitoru proteázy (Roche, Merck). Lyzát byl centrifugován při 20,000 g po dobu 30 minut při 4 stupních a supernatant byl skladován při -20 stupních. Koncentrace proteinu byly stanoveny v duplikátech (standardní) nebo triplikátech (vzorky) pomocí BCA testu (Pierce, Thermo Fisher) podle pokynů výrobce. Přibližně 20 ug celkového proteinu bylo frakcionováno pomocí SDSPAGE a přeneseno na PVDF membránu (1,5 h, 100 V). Membrány byly blokovány ve 2% sušeném mléce v TBST. Western blot byl proveden s použitím polyklonálního králičího anti-HaloTag (Promega #G9281, 1:500, 4 stupně přes noc), následovalo promytí a inkubace s oslím IgG anti-králičím IgG (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # {{46 }}, dianova, 1:20,000, 1 h při pokojové teplotě), mytí a vylepšená chemiluminiscenční detekce (Amersham ECL Prime Western blotting Detection Reagent, GE Healthcare). Bloty byly stripovány pomocí ROTIFree Stripping Buffer 2.0 (Carl Roth), blokovány ve 2% sušeném mléce v TBST přes noc při 4 stupních a inkubovány s monoklonální myší anti-FLAG M2 (SigmaAldrich #F1804, Merck, 1:1,{{69} }, 1,5 h při pokojové teplotě), následovaný oslí IgG anti-myší IgG (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # 715-035-151, dianova, 1:20,000, 1 h na pokoj teplota), detekce ECL, stripování a blokování, jak je uvedeno výše. Bloty byly poté inkubovány s monoklonálním myším anti- -aktinem (Sigma-Aldrich # A2228, Merck, 1:5 000, 1 h při teplotě místnosti) a oslím IgG anti-myším IgG, opět následovala detekce ECL. Pásy byly kvantifikovány pomocí softwaru Image Lab Software na ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad). Intenzity pruhů detekovaných protilátkou anti-HaloTag a protilátkou anti-FLAG M2, v daném pořadí, byly vyděleny odpovídajícími intenzitami pruhů detekovaných protilátkami anti- - aktinu. Pro hodnocení hladin exprese KLHL3 byly buňky transfekovány, jak je uvedeno výše, s použitím 0 ug, 0,5 ug, 1 ug, 2 ug, 4 ug a 8 ug pFN21A KLHL3 WT nebo R431W. Gelová elektroforéza a blotování byly provedeny jako výše. Pro test cykloheximidu byly buňky naočkovány, jak je uvedeno výše, a transfekovány, jak je uvedeno výše, avšak s 2 ug pFN21A KLHL3 WT nebo 4 ug KLHL3 R431W. Čtyřicet osm hodin po transfekci bylo přidáno 100 uM cykloheximidu a buňky byly lyžovány po uvedených časových bodech. Další kroky analýzy byly jako výše.
Obr. 2. MD simulace domén WT a p.Arg431Trp (R431W) KLHL3 Kelch. pohled shora dolů na Kelchovu doménu (PDBID: 4CH9), obarvenou listy vrtule (K1–K6). Místo mutace je označeno žlutou hvězdou a oblast zájmu je zbarvena šedě (zbytky 425–465) a peptid WNK4 (není součástí simulací) je průhledný a zbarvený šedě. b Rozdíl v MSF Kelchovy domény mapované na proteinové páteři. Místo mutace je označeno žlutou hvězdou. Červená barva označuje dynamičtější (méně stabilní) části proteinu. c RMSD celého proteinu (nahoře), zbytky 425–465 (uprostřed) a vazebnou kapsu WNK4-(dole) z krystalové struktury pro tři nezávislé simulační repliky (tučné čáry, průběžné průměry). d Houslové grafy hbondů (vlevo) a vzdálenosti COM (uprostřed) mezi K3 (zbytky 425–441) a K4 (442–465) – listy vrtule a elektrostatika vázací kapsy (vpravo). e Strukturální překrytí rozhraní K3–K4 z konečného snímku (1,1 μs) každé repliky (WT, modrá; R431W, šedá) s experimentálními/počátečními modely (černá). Proteinová kostra je zobrazena jako karikatura se zbytkem 431 zobrazeným jako tyčinky. Lékaři bez hranic, střední kvadratická fluktuace.
Simulace molekulární dynamiky
Model WT byl založen na rentgenové krystalové struktuře (PDBID: 4CH9) lidské Kelchovy domény v komplexu s peptidovým fragmentem WNK4 [26]. Chybějící atomy a koncové uzávěry byly přidány pomocí nástroje psfgen ve vizuální molekulární dynamice verze 1.9.3 [27]. Mutantní (R431W) model KLHL3 byl vytvořen pomocí Modeller verze 9.18 [28]. Konečný rozsah zbytků pro každý systém byl 300–585. N- a C-konce modelů WT a R431W byly neutralizovány acetylací a N-methylamidací, v daném pořadí. Výchozí protonační stavy byly přiřazeny každému titrovatelnému zbytku podle analýzy pomocí PROPKA verze 3.0 [29]. Peptid WNK4 byl odstraněn z produkčních simulací v důsledku disociace z KLHL3 po počátečních ekvilibračních simulacích.
Všechny simulace byly provedeny pomocí softwarového balíčku GROMACS verze 2021 [30]. Pro atomy proteinů byly použity parametry silového pole CHARMM36m [31]. Ionty byly popsány pomocí výchozích parametrů CHARMM a pro vody byl použit model TIP3P [32]. Pro počáteční ekvilibrační krok byl použit integrační časový krok 1 fs, přičemž pro všechny následující simulace byly použity 2 fs. Všechny vazby zahrnující vodík byly omezeny pomocí LINCS [33]. Nevazebné Van der Waalsovy interakce byly vypočteny pomocí Lennard-Jonesova potenciálu s hraničním poloměrem 1,2 nm; síly byly plynule vypnuty v rozsahu 1,2–1,0 nm. Veškerá elektrostatika byla vypočtena pomocí metody Ewald [34] s vyhlazenými částicemi s mezní vzdáleností v reálném prostoru 1,2 nm. Po počáteční simulaci v isochoricko-izotermickém souboru (NVT) byly všechny následné simulace provedeny v isobaricko-izotermickém souboru (NPT) při teplotě 310,15 K pomocí termostatu pro změnu velikosti rychlosti [35] s časovou konstantou 0,5 ps. Termostat byl aplikován odděleně na protein a rozpouštědlo (tj. vodu a ionty); stejné skupiny byly použity pro odstranění pohybu těžiště (COM). Tlak 1 bar byl zaveden pomocí barostatu Berendsen [36] nebo Parrinello-Rahman [37] izotropním způsobem s časovou konstantou 5 ps.
Modely WT a R431W byly solvatovány v krychlovém boxu s počátečními rozměry 1,2 × 1,2 × 1,2 nm3. Každý systém byl neutralizován 150 mM NaCl. Po počáteční minimalizaci energie nejstrmějšího sestupu byl každý systém ekvilibrován v souboru NVT po dobu 5 ns s omezením polohy na všech atomech proteinu. Následný krok ekvilibrace byl proveden v souboru NPT po dobu 5 ns se stejnými omezeními jako v předchozím kroku. Pro konečnou ekvilibrační simulaci 5-ns byla odstraněna polohová omezení ze všech postranních řetězců. Z konečného stupně ekvilibrace byly vygenerovány tři počáteční struktury pro nezávislé simulace výroby systémů WT a R431W s odstraněnými všemi polohovými omezeními. Každý produkční replikát byl simulován po dobu 1,1 us; prvních 0,1 us bylo z analýzy odstraněno.
Pro posouzení strukturální stability v průběhu simulací byly vypočteny střední kvadratické odchylky (RMSD) od krystalové struktury pro atomy C celého proteinu, stejně jako rozhraní K3–K4 (zbytky 425–465) a Kapsa vazby WNK4- (zbytky 339, 355, 360, 386, 402, 407, 432, 449, 451, 481, 498, 528 a 577). Byly vypočteny průběžné průměry křivek RMSD a překryty nezpracovanými daty.
Účinek mutace na strukturální stabilitu byl vizualizován výpočtem rozdílu ve středních čtvercových fluktuacích atomů proteinu C, zprůměrovaných přes rámce a repliky a mapováním na strukturu proteinu WT. Všechny vizualizace proteinů byly vytvořeny pomocí ChimeraX [38]. Vliv mutace R431W na rozhraní K3 (zbytky 425–441) až K4 (zbytky 442–465) byl charakterizován analýzou vodíkové vazby (H-vazba) a vzdáleností COM mezi těmito dvěma skupinami. H-vazby byly posouzeny u každého rámu pomocí nástroje GROMACS gmx hbond se vzdáleností a úhlem 3,5 Á a 30 stupňů, v daném pořadí. Vzdálenosti COM byly podobně hodnoceny v každém snímku – distribuce vzdáleností Hbond a COM byly vizualizovány jako houslové grafy. Průměry byly vypočteny pro trajektorie a repliky.
Elektrostatika WNK4-vazbové kapsy byla vypočtena pomocí g_elpotu [39]. Časový průběh elektrostatického potenciálu ve vazebné kapse byl hodnocen definováním sférického objemu s poloměrem 8 Á, se středem v geometrickém středu zbytků tvořících vazebnou kapsu. Pro vyhodnocení rozptylu elektrostatiky byly vypočteny průměry bloků 50-ns. Distribuce elektrostatického potenciálu ve vazebné kapse pro mutanty WT a R431W byla vizualizována jako houslové grafy, s průměry vypočtenými pro 50-ns bloky a trajektorie.
Supporting Service Of Wecistanche-Největší vývozce cistanche v Číně:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Nakupujte pro další specifikace Podrobnosti:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
