Studie o ochranném mechanismu celkových glykosidů Cistanche Deserticola proti zraněním způsobeným alkoholem v primárních kultivovaných myších jaterních buňkách
Jun 04, 2025
Objektivní:
Studovat ochranný účinek celkových glykosidů Cistanche deserticola na primárně kultivované hepatocyty. Metody: Primární hepatocyty byly odebrány perfuzní metodou in situ a metodou MTT byl hodnocen účinek celkových glykosidů Cistanche deserticola na přežití primárně kultivovaných hepatocytů poraněných alkoholem; Vliv celkových glykosidů Cistanche deserticola na morfologii primárně kultivovaných hepatocytů a jader poškozených alkoholem byl hodnocen fluorescenční mikroskopií; Průtokovou cytometrií byl detekován vliv celkových glykosidů Cistanche deserticola na apoptózu primárně kultivovaných hepatocytů poškozených alkoholem; Imunocytochemické barvení bylo použito k detekci účinku celkových glykosidů Cistanche deserticola na expresi bcl-2 a c-fos. Výsledky: Po poranění alkoholem se míra přežití primárních hepatocytů snížila a byly patrné změny v apoptóze a nekróze. Exprese genu inhibujícího apoptózu bcl-2 se snížila a exprese genu podporujícího apoptózu c-fos se zvýšila. Celkové glykosidy Cistanche deserticola mohou významně zlepšit míru přežití buněk, zlepšit apoptózu a nekrózu, zvýšit expresi bcl-2 a inhibovat expresi c-fos. Účinek byl závislý na dávce. Závěr: Glykosidy Cistanche deserticola mohou chránit primárně kultivované hepatocyty zvýšením exprese genu bcl-2 inhibujícího apoptózu, snížením exprese genu podporujícího apoptózu c-fos, snížením apoptózy a nekrózy a zvýšením míry přežití buněk.
Klíčová slova: celkové glykosidy Cistanche deserticola; primární kultura; hepatocyt; Alkoholické poškození jater; Apoptóza
Prášek z extraktu cistanche
V posledních letech se se zlepšováním životní úrovně lidí prudce zvyšuje spotřeba alkoholu doprovázená nárůstem různých onemocnění souvisejících s alkoholem a jedním z důležitých problémů je alkoholické poškození jater. Studie ukázaly, že Cistanche deserticola má ochranné účinky na posílení imunitní funkce, proti stárnutí, proti radiaci, proti oxidaci, proti peroxidaci lipidů a na poškození jater vyvolané alkoholem [1]. Glykosidy jsou hlavními účinnými látkami Cistanche deserticola.V předchozích experimentech bylo ověřeno pokusy na zvířatech, že celkové glykosidy Cistanche deserticola mohou snižovat produkci volných radikálů, zvyšovat schopnost vychytávání volných radikálů a jejich metabolitů, čímž inhibují peroxidaci lipidů, a hrají ochrannou roli při poškození jater alkoholem.[2]. Tento experiment bude zkoumat ochranný účinek celkových glykosidů Cistanche deserticola na alkoholické poškození jater na buněčné úrovni prostřednictvím primární kultury hepatocytů.
1. Materiály a metody
1.1 Činidlo a přístroj Celkové glykosidy Cistanche deserticola, tmavě hnědý prášek, poskytovaný Farmaceutickou fakultou Univerzity Lanzhou, obsahuje 88,6 % celkových glykosidů fenylethanolu. Rozpusťte v dvakrát destilované vodě a nařeďte roztok kultury na požadovanou koncentraci. Enzymový marker (Beckman Coulter AD340), fluorescenční mikroskop (Olympus, BX51), invertovaný fázový kontrastní mikroskop (Leica DMI3000B), průtoková cytometrie (Beckman colter cell, CellLabQuanta SC) atd.
Cistanche prášek
Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche deserticola pro ochranu jater
【Požádejte o více】 E-mail: xue122522@foxmail.com / WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
1.2 Primární hepatocyty byly izolovány a kultivovány perfuzní metodou in situ [3].
Jedna Kunmingova myš byla anestetizována 0,5% pentobarbitalem 0,5 ml intraperitoneální injekcí. Po rutinní dezinfekci kůže otevřete břicho, posuňte gastrointestinální trakt doleva, odkryjte portální žílu, opatrně propíchněte infuzní jehlu infuzního zařízení ze vzdáleného konce portální žíly a podvázejte ji a zafixujte. Otočte průtok infuzní soupravy na maximum (asi 4 ml/min) a kápněte preperfuzní roztok bez vápníku předehřátý na 37 stupňů. Když jsou játra oteklá, rychle odřízněte distální konec dolní duté žíly a přerušovaně stlačujte proximální konec dolní duté žíly tak, aby se játra střídavě zatahovala a roztahovala. Když je zbytková krev vymyta a játra jsou rovnoměrně žlutá a bílá, použije se teplý perfuzní roztok 0,05% kolagenázy (Sigma) pro perfuzi trávení. Trávení se zastaví, když játra změknou a nepruží, pod jaterním pouzdrem se objeví malé vakuoly nebo dokonce praskliny v jaterní tkáni. Pečlivě disociujte játra, přeneste je na sterilní misku obsahující správné množství DMEM kultivačního média s vysokým obsahem cukru (Sigma), odloupněte jaterní obal a jemně jej protřepejte, poté rozsypte hepatocyty v kultivačním médiu, shromážděte je do kónické zkumavky, protřepejte a kultivujte po dobu 10 minut (frekvence vibrací je 100krát/min), centrifugujte 4000000 x 1 min. supernatant. Buňky byly suspendovány v kultivačním médiu, filtrovány přes nylonovou síť 200 mesh a filtrát byl opakovaně 3krát centrifugován (4 stupně, 1000 ot./min.), aby se získaly buňky jaterního parenchymu. Upravte koncentraci buněk na 5 x 106 buněk/ml, naočkujte je do 25ml kultivační baňky předem ošetřené kolagenem z krysího ocasu a poté je inkubujte v inkubátoru při 37 stupních, 5% CO2. Po 24 hodinách vyměňte roztok, zlikvidujte neadherentní buňky a pokračujte v kultivaci pro použití v následujících experimentech.
1.3 Stanovení růstové křivky primárně kultivovaných myších hepatocytů
Upravte purifikované hepatocyty na 5 x 106 buněk/ml, naočkujte je do 24jamkové destičky a do každé jamky se naočkoval 1 ml buněčné suspenze. Celkem bylo naočkováno 21 jamek a kultivační médium DMEM s vysokým obsahem cukru obsahující 10% fetální bovinní sérum (Sigma) bylo kultivováno po dobu 7 dnů. Vezměte 3 náhodně každý den, strávte a vyfoukněte 0,25 % trypsinu rovnoměrně, počítejte na počítací desce a nakreslete křivku růstu
1.4 Vytvoření modelu alkoholického poškození hepatocytů.
Logaritmické hepatocyty získané výše uvedeným způsobem byly naočkovány do 96jamkové destičky předem ošetřené kolagenem z potkaního ocasu a do každé jamky bylo naočkováno 100 buněk s 50 ul. Kultivační médium DMEM s 10% fetálním bovinním sérem bylo kultivováno po dobu 24 hodin a poté vyměněno na dalších 24 hodin. Byla vytvořena slepá skupina a pět intervenčních skupin pro alkohol (50, 75, 100, 125, 150 mmol/l) a každá skupina měla pět opakování. Poté, co byly hepatocyty kultivovány s různými koncentracemi alkoholu po dobu 24 hodin, bylo do každé jamky přidáno 0,5% MTT (Sigma) 20 μ 50 ul. Pokračujte v kultivaci po dobu 4 hodin, odstraňte supernatant a přidejte DMSO 150 do každé jamky μ 50. Vložte do třepacího stolu a míchejte 15 minut, změřte hodnotu absorbance při 570 nm a vypočítejte míru přežití buněk. Hodnota míry přežití buněk u podávané skupiny/kontrolní skupiny × 100 %
1.5 Vliv celkových glykosidů Cistanche deserticola na míru přežití primárně kultivovaných hepatocytů
Zraněný alkoholem. Naočkujte hepatocyty získané výše uvedenými metodami na 96jamkovou destičku předem ošetřenou kolagenem z potkaního ocasu a naočkujte každou jamku 100 μl nebo 50 μl. Kultivační médium DMEM s 10% fetálním bovinním sérem bylo kultivováno po dobu 24 hodin a poté vyměněno. Po dalších 24 hodinách byly do skupiny, které byla podávána, přidány GC s konečnou koncentrací 0,2, 0,4 a 0,8 g/l. Modelová skupina ethanolu a slepá skupina pokračovaly v kultivaci bez přidání léků a každá skupina byla nastavena s pěti více jamkami. Po 24 hodinách byl modelové skupině a intervenční skupině GC přidán alkohol s konečnou koncentrací 100 mmol/l. Po 12 hodinách kultivace byla měřena míra přežití buněk metodou MTT.
1.6 Vliv celkových glykosidů Cistanche deserticola na morfologii primárně kultivovaných hepatocytů a jader poškozených alkoholem
Předsterilizované krycí sklo vložte do 6jamkové destičky s inokulační koncentrací 5 x 106 buněk/ml buněčné suspenze, modelová skupina, skupina Cistanche deserticola (0,2, 0,4, 0,8 g/l) a slepá skupina. Po 24 hodinách kultivace přidejte 100 mmol/l alkoholu na konečnou koncentraci. Po 24 hodinách kultivace vyjměte 95% ethanol ze sklíčka a fixujte jej po dobu 15 minut. PBS se dvakrát promyje a poté se znovu disperguje v PBS. Upravte koncentraci buněk na 5 × 104 buněk/ml, přidejte 10 μl směsi akridinové oranže a ethylidenbromidu (Sigma) (0,01 μG/ml roztoku akridinové pomeranče, 0,02 μG/ml roztoku prometazinu, směsný objemový poměr: 1/1), inkubováno a fotografováno pod mikroskopem, fluorescence pozorováno 30 min.
1.7 Vliv celkových glykosidů Cistanche deserticola na apoptózu primárně kultivovaných hepatocytů poškozených alkoholem
Upravte hustotu štěpené buněčné suspenze na 5 × 106 buněk/ml, naočkujte do šestijamkové destičky a kultivujte 24 hodin. Nastavte modelovou skupinu, skupinu cistanche deserticola (0,2, 0,4, 0,8 g/l) a prázdnou skupinu. Po 24 hodinách kultivace přidejte alkohol s konečnou koncentrací 100 mmol/l, inkubujte 24 hodin, štěpte a sbírejte buňky, dvakrát je promyjte PBS, fixujte je při 4 stupních přes noc 70% předchlazeným ethanolem, dvakrát promyjte roztokem PBS, přidejte RNA enzym (Sigma), PI (100 μ G/ml), 3 st., vložte do vodní lázně (Sigma) Rychlost apoptózy byla měřena průtokovou cytometrií.
1.8 Celkové glykosidy Cistanche deserticola mohou inhibovat apoptózu primárně kultivovaných hepatocytů poškozených alkoholem, bcl-2 a proapoptotickým genem c-fos
Účinek exprese fos byl vzat ze tří šestijamkových kultivačních destiček, z nichž každá byla skupinou tří jamek. Byla vytvořena modelová skupina, skupina Cistanche deserticola (0,2, 0,4, 0,8 g/l), a slepá skupina. Do každého otvoru bylo umístěno jedno sterilní sklíčko. Byly odebrány buňky z logaritmické růstové fáze a štěpení trypsinem bylo použito k přípravě suspenze jednotlivých buněk a hustota buněk byla upravena na 5 x 106/ml a naočkována na 6-jamkovou destičku, 2 ml/jamka. Po 24 hodinách kultivace přidejte alkohol o konečné koncentraci 100 mmol/l a pokračujte v kultivaci 24 hodin. Vyjměte sklíčka plná buněk, dvakrát je promyjte PBS a obarvěte je rutinní imunohistochemickou metodou ABC. Krátké kroky jsou následující: fixujte je 40% paraformaldehydem po dobu 10 minut, uzavřete je normálním ovčím sérem po dobu 30 minut, kápněte a přidejte polyklonální protilátku bcl-2 (Invitrogen) (1:75) nebo polyklonální protilátku c-fos (Invitrogen) (1:50), reagujte při pokojové teplotě po dobu 1,5 hodiny při pokojové teplotě, přidejte komplex DAB, zalepte je komplexem ABC želatina. Exprese Bcl-2 a c-fos proteinu byla porovnána pomocí světelné mikroskopie a fotografie.
1.9 Statistické zpracování Experimentální data byla zpracována softwarem SPSS 13.5. Vyjadřuje se jako průměr ± standardní odchylka (x ± s) a pro srovnání mezi skupinami se používá t-test. P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.
2 Výsledky
2.1 Křivka růstu primárně kultivovaných myších hepatocytů je znázorněna na obrázku 1. Je vidět, že počet hepatocytů se zvyšoval s inkubační dobou a 4. den vstoupil do logaritmické růstové fáze.
2.2 Vliv různých koncentrací alkoholu na míru přežití primárně kultivovaných myších hepatocytů
Z tabulky 1 je vidět, že alkohol má silný škodlivý účinek na primárně kultivované hepatocyty a účinek je závislý na dávce. Podle potřeb testu bude jako pracovní koncentrace v následném testu použito 100 mmol/l a míra přežití buněk je 43,40 %.
2.3 Vliv celkových glykosidů Cistanche deserticola na míru přežití primárně kultivovaných hepatocytů poškozených alkoholem
Lze vidět v tabulce 2. Po poranění alkoholem je míra přežití hepatocytů významně snížena. Celkové glykosidy Cistanche deserticola mohou významně zvýšit míru přežití hepatocytů (P<0.05), and the effect is dose-dependent (P<0.05).
pouštní ženšen
2.4 Vliv celkových glykosidů Cistanche deserticola na morfologii primárně kultivovaných hepatocytů a jader poškozených alkoholem.
Azidinová oranž po vstupu do buněk vykazuje zelenou fluorescenci, zatímco promethazin může obarvit pouze nekrotické buňky s neúplnou buněčnou membránou. Pozorováním (obr.. 2) bylo zjištěno, že hepatocyty ve slepé skupině byly jednotně zelené a nebylo zde žádné barvení nekrotických buněk bromovou červení (A); Po ošetření alkoholem se hepatocyty zmenšily a objevilo se velké množství nekrotických buněk obarvených bromovou červení a apoptotických buněk s koncentrací chromatinu v jádře (jádro bylo jasně zelené) (B). Proto se má za to, že alkohol může také způsobit nekrózu buněk, zatímco indukuje apoptózu hepatocytů. GC mohou významně snížit nekrózu a apoptózu a účinek pozitivně koreluje s dávkou (C, D, E).
Obr. 2 Pozorování účinku celkových glykosidů Cistanche deserticola na morfologii primárních kultivovaných jaterních jader pod fluorescenčním mikroskopem (barvení akridinovou oranží, 400)
A: Prázdná skupina; B: Modelová skupina; C:0.2g/L-GC; D:0.4g/L-GC; E:0.8g/L-GC
2.5 Vliv celkových glykosidů cistanche deserticola na apoptózu primárně kultivovaných hepatocytů poškozených alkoholem
Prášek z extraktu cistanche
Jak je vidět na obrázku 3-B, míra apoptózy hepatocytů po poškození alkoholem je významně zvýšena (34,7 %) a celkové glykosidy Cistanche deserticola mohou významně zvýšit míru přežití hepatocytů v závislosti na dávce, což je v souladu s výsledky pozorovanými pod fluorescenčním mikroskopem.
Obr. 3 Vliv celkových glykosidů Cistanche deserticola na apoptózu primárně kultivovaných hepatocytů poškozených alkoholem
A: Prázdná skupina; B: Modelová skupina; C:0.2g/L-GC; D:0.4g/L-GC; E:0.8g/L-GC
Imunocytochemií bylo zjištěno, že po poškození jaterních buněk alkoholem se snížila exprese faktoru bcl-2 inhibujícího apoptózu (4-B) a zvýšila se exprese c-fos (5-B). Celkové glykosidy Cistanche deserticola mohou významně zvýšit expresi bcl-2 (4-C, D, E) a inhibovat expresi c-fos (5-C, D, E). Výsledky jsou zobrazeny na obr. 4-5.
Obr. 4 Vliv celkových glykosidů Cistanche deserticola na expresi bcl-2 v primárně kultivovaných hepatocytech poraněných alkoholem (400)
A: Prázdná skupina; B: Modelová skupina; C:0.2g/L-GC; D:0.4g/L-GC; E:0.8g/L-GC
Obr. 5 Vliv celkových glykosidů Cistanche deserticola na expresi c-fos v primárně kultivovaných hepatocytech poškozených alkoholem (400)
A: Prázdná skupina; B: Modelová skupina; C:0.2g/L-GC; D:0.4g/L-GC; E:0.8g/L-GC
3 Diskuse
Čínská bylina cistanche
Berry a kol. nejprve zavedli in-situ perfuzní metodu použití kolagenázy k perfuzi jater k získání hepatocytů za fyziologických podmínek a později ji vyvinuli Seglen et al. [4] to make this collagenase perfusion technology more perfect. This method has a high cell yield and a high survival rate. In this experiment, primary hepatocytes were obtained by in situ perfusion of mouse hepatocytes and cultured. The method was stable, and the cell activity was strong. Through the growth curve test, it was found that the primary hepatocytes obtained entered the logarithmic growth phase after 4 days.
MTT kolorimetrická mikroanalýza je citlivá metoda pro detekci buněčného růstu a přežití s dobrou opakovatelností. Sukcinátdehydrogenáza v mitochondriích živých buněk dokáže redukovat žluté MTT na modrofialové krystaly, zatímco mrtvé buňky takovou funkci nemají [5]. Buněčná aktivita se může projevit měřením optické hustoty. V tomto experimentu byla metoda MTT použita ke zjištění, že míra přežití hepatocytů po poškození alkoholem byla významně snížena a celkové glykosidy Cistanche deserticola mohly významně zvýšit míru přežití hepatocytů (P<0.05), and the effect was dose-dependent (P<0.05).
Apoptóza je zvláštní forma buněčné smrti. When cells undergo apoptosis, special morphological and biochemical changes will occur [6-8]. Experiment potvrdil, že většina hepatocytů byla po ošetření alkoholem apoptotická a buňky vykazovaly zjevné morfologické změny, které byly následující: buňky se zmenšily, mikroklky na buněčném povrchu zmizely, buněčný povrch se zmenšil, došlo k vakuolám, jaderné kondenzaci a tvorbě apoptotických tělísek; Je doprovázena nekrózou. Po léčbě celkovými glykosidy Cistanche deserticola se výrazně snížila rychlost apoptózy a také se zmírnila situace nekrózy.
Gen bcl-2 je protoonkogen. V současné době bylo nalezeno pět genových rodin bcl-2 (bcl-2, bcl-2 x, bax, mcl-1 a A1), ve kterých bcl-2 může inhibovat programovanou buněčnou smrt (PCD). Práce mechanismu může zahrnovat: (1) inhibici uvolňování Ca2+. Bcl-2 je transmembránový protein, který se nachází hlavně na jaderné membráně. Vnitřní a vnější jaderné membrány jsou spojeny lumen endoplazmatického retikula. Ten je hlavním úložištěm intracelulárního Ca2+, který hraje důležitou roli v procesu buněčné apoptózy. Pomocí transgenních metod bylo zjištěno, že vysoká exprese bcl-2 by mohla inhibovat uvolňování Ca2+ z endoplazmatického retikula, takže se spekulovalo, že inhibiční účinek bcl-2 na apoptózu může souviset s Ca2+ v endoplazmatickém retikulu [9]. (2) Bcl-2 hraje antiapoptotickou roli blokováním přenosu signálu proapoptotických genů nebo blokováním těchto indukovatelných genových produktů. Studie ukázaly, že protein bcl-2 může inhibovat apoptózu indukovanou P53 a c-fos [10]. (3) Bcl-2 může hrát antiapoptotickou roli inhibicí volných radikálů. Bcl-2 má roli antioxidantu, který může inhibovat produkci a působení superoxidu, a tím inhibovat výskyt apoptózy [11].
Časné okamžité geny (IEG) jsou geny, které se objevují časně a mají krátké trvání pod různými škodlivými podněty. c-fos je jeden z protoonkogenů, který se nachází na chromozomu 14q21-q31. Jedná se o 9kb DNA, složenou ze čtyř exonů a tří intronů [12]. Základní transkripce je nízká, ale může být spuštěna různými molekulami druhého posla pro rychlou a přechodnou expresi. Proteinový produkt c-fos je FOS a protein kódovaný protoonkogenem c-Jun je JUN. FOS obsahuje leucinový zip (LZ) [13]. FOS a JUN tvoří v jádře prostřednictvím struktury LZ heterodimer, nazývaný transkripční faktor AP-1, který se spojuje s místem AP-1 cílového genu a působí jako třetí posel jádra, což umožňuje expresi cílového genu po dlouhou dobu [14]. Morgan věří, že různé výrazy c-fos naznačují rozmanitost a složitost jeho funkcí. Přechodná exprese se může podílet na ochraně, opravě, remodelaci a regeneraci buňky, zatímco trvalá nadměrná exprese souvisí se sekundárním poškozením. Expresní mechanismus těchto dvou je odlišný. Proto lze mít za to, že IEG, jako je c-fos, hrají dvojí roli. Když je opravný obranný systém zcela inhibován, účastní se apoptózy; Pokud není inhibován, má ochranný účinek na buňky v okolí léze a podílí se na procesu buněčné opravy a regenerace [15]. WebsterKR používá antisense nukleotidy ke snížení transkripce c-fos a prevenci výskytu apoptózy, což ukazuje, že nadměrná exprese c-fos je neoddělitelně spojena s výskytem a rozvojem různých onemocnění [16].
V tomto experimentu po poškození jaterních buněk alkoholem byla exprese faktoru bcl-2 inhibujícího apoptózu významně snížena a exprese c-fos byla zvýšena, což naznačuje, že celkové glykosidy Cistanche deserticola by mohly chránit jaterní buňky zvýšením exprese bcl-2, inhibicí exprese c-fos, snížením poškození jaterních buněk a apoptózou.
