Abstraktní

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight, vzácná bylina homologní pro potraviny a léčiva z čeledi Orobanchaceae, se široce pěstuje v jižním Sin-ťiangu v Číně. Jeho hlavní bioaktivní fenylethanoidní glykosidové složky,echinakosidaakteosid (verbaskosid)poskytují četné farmakologické aktivity včetně antioxidační, protizánětlivé a imunitní regulace. Nestandardizované tradiční postupy zpracování často způsobují značné ztráty těchto základních aktivních látek, což omezuje jejich použití v lékařství a funkčních potravináchCistanche tubulosakousky odvaru. Cílem tohoto výzkumu bylo optimalizovat moderní parametry zpracování pro čerstvéCistanche tubulosaplátky, aby se maximalizovala regenerace akteosidů a echinakosidu a dále objasnil antioxidační stres a protizánětlivá bioaktivita a také základní molekulární mechanismus optimálně zpracovaných kousků odvaru na buněčné úrovni.

Byly provedeny jednofaktorové experimenty pro screening vhodných rozsahů pro tloušťku plátků, dobu vaření v páře a teplotu sušení v troubě. Třífaktorová tříúrovňová Box-Behnkenova metodologie povrchu odezvy byla přijata k vytvoření vícefaktorových interakčních modelů s použitím obsahu akteosidů a echinakosidu jako indikátorů dvojího hodnocení. Následně byl vytvořen model myších makrofágových buněk RAW264.7 stimulovaný lipopolysacharidem (LPS) pro simulaci peroxidace lipidů a akutního zánětlivého poškození. Byla implementována řada biochemických testů včetně MTT, fluorescenční detekce ROS, ELISA a Western blot, aby se vyhodnotila účinnost antioxidačního stresu a prozkoumaly dráhy přenosu signálu.

Podle experimentálních výsledků byly stanoveny optimální parametry zpracování jako tloušťka plátku 0,6 cm, úprava v páře po dobu 6 minut a teplota sušení nastavená na 57 stupňů. Za těchto podmínek praktického zpracování dosáhl naměřený obsah akteosidu a echinakosidu 7,25 %, resp. 31,62 %, což vykazuje dobrou shodu s teoretickými předpovědními hodnotami. Buněčné testy odhalily, že optimálně zpracovanéCistanche tubulosaExtrakty z odvarových kousků významně snížily koncentrace oxidu dusnatého (NO) a malondialdehydu (MDA) v makrofázích RAW264.7 infikovaných LPS. Mezitím výrazně zvýšil intracelulární antioxidační enzymové aktivity superoxiddismutázy (SOD), katalázy (CAT), laktátdehydrogenázy (LDH) spolu se zvýšeným obsahem glutathionu (GSH). Hladiny sekrece prozánětlivých mediátorů včetně TNF‑, IL‑1 a IL‑6 byly také potlačeny v závislosti na dávce. Detekce Western blot to potvrdilaCistanche tubulosaextrakty omezily nadměrnou fosforylaci klíčových proteinů v signálních kaskádách p38/AKT/JNK/NF‑κB.

Stručně řečeno, tento optimalizovaný moderní protokol zpracování účinně zlepšuje výtěžky charakteristických fenylethanoidových glykosidů (akteosid a echinakosid) vCistanche tubulosakousky odvaru. Zpracovaný rostlinný materiál vykazuje výrazné antioxidačně-stresové a protizánětlivé účinky v modelu poškození makrofágů indukovaného LPS, jehož farmakologický mechanismus je částečně realizován prostřednictvím inhibice nadměrné aktivace osy zánětlivé signalizace p38/AKT/JNK/NF‑κB. Tato práce poskytuje spolehlivé technické parametry pro standardizovanou průmyslovou výrobu a poskytuje experimentální podporu pro vývoj antioxidačních funkčních potravin odvozených zCistanche tubulosa.

Klíčová slova: Cistanche tubulosa; technologie zpracování odvarových kusů; akteosid; echinakosid; antioxidační stres; makrofág RAW264.7; signální dráha p38/AKT/JNK/NF‑κB

1. Úvod

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight patří do čeledi Orobanchaceae a jeho masitý šupinatý stonek je oficiální léčivou částí. Tato pouštní léčivá rostlina se z velké části pěstuje ve vyprahlém jižním Sin-ťiangu v Číně. V tradiční čínské bylinné praxi,Cistanche tubulosaslouží jako klasická tonická bylina s prokázanými terapeutickými funkcemi tonizující ledviny-jang, doplňování esence-krev a uvolňující pohyb střev. Klinicky se používá ke zmírnění bolestivosti-slabosti beder a kolen, neplodnosti způsobené nedostatkem ledvin a zácpy vyvolané suchostí střev.

Fenylethanoidové glykosidy představují nejkritičtější bioaktivní markeryCistanche tubulosa. Čínský lékopis stanoví, že celkový obsah echinakosidu a akteosidu by u kvalifikovaných léčivých materiálů neměl být nižší než 1,50 %. Nicméně současná mainstreamová výrobaCistanche tubulosaodvarové kousky stále většinou dodržují staré ruční pracovní postupy: namáčení čerstvé syrové bylinky, důkladné navlhčení, krájení a přirozené sušení nebo zpracování vína v páře. Tyto konvenční přístupy postrádají přesné kvantitativní technické specifikace. Tepelná nestabilita fenylethanoidních glykosidů často vede k těžké degradaci aktivních látek během zpracování, což snižuje kvalitu finálního produktu a omezuje velkosériovou vysoce kvalitní výrobu. V současnosti pouze omezený výzkum současně kombinuje optimalizaci technologie zpracování s ověřováním biologické aktivity; většina studií pouze detekuje obsah chemických složek bez ověření buněčné funkce, což vytváří mezery pro průmyslovou transformaci.

Oxidační stres působí jako hlavní patologický spouštěč mnoha chronických metabolických a zánětlivých onemocnění. Nadměrná akumulace reaktivních kyslíkových druhů (ROS) narušuje redoxní homeostázu, dále vyvolává nadměrnou aktivaci makrofágů a masivní uvolňování prozánětlivých cytokinů, což vytváří začarovaný kruh mezi oxidací a zánětem. Stávající farmakologické výzkumy to prokázalyCistanchefenylethanoidové glykosidy původního původu mají antioxidační a protizánětlivé vlastnosti. Předchozí pokusy na zvířatech to ukázalyCistanche tubulosacelkové glykosidy zlepšily poškození jater v modelech sepse na hlodavcích aktivací antioxidační signalizace Nrf2/HO‑1. Lignan-glykosidové složky izolované zCistanche tubulosamohl zmírnit LPS-provokované zánětlivé reakce prostřednictvím modulace dráhy PI3K/AKT v makrofázích RAW264.7. Zda si však odvarové kousky vyrobené za nově optimalizovaných podmínek zpracování zachovávají silnou antioxidační stresovou bioaktivitu, nebylo systematicky hodnoceno. Konkrétní molekulární regulační mechanismus stále vyžaduje hlubší průzkum.

Makrofág RAW264.7 stimulovaný LPS je dobře přijímaný in vitro model zánětu a oxidativního poškození, široce používaný pro hodnocení antioxidačních a protizánětlivých účinků přírodního produktu. V této studii nejprve provádíme jednofaktorový screening následovaný Box-Behnkenovou optimalizací povrchu odezvy, abychom získali standardizované technické parametry krájení-paření-sušení zaměřené na vysoké výtěžky akteosidů a echinakosidu. Po získání optimalizovaných odvarových produktů připravujeme bylinné extrakty a přijímáme model buněčného poškození RAW264.7 indukovaný LPS. K objasnění účinnosti antioxidačního stresu a mechanismu přenosu signálu se využívá více experimentálních platforem, včetně měření oxidativního stresu, biochemických markerů, kvantifikace cytokinů ELISA a analýzy Western blot. Tento výzkum poskytuje praktické parametry procesu pro poloprovozní výrobu vysoké kvalityCistanche tubulosakousky odvaru se stabilní antioxidační-stresovou aktivitou a položí experimentální základ pro následný vývoj funkčních potravin a produktů doplňků stravy pocházejících ze Sin-ťianguCistanche tubulosazdroje.

2. Materiály a metody

2.1 Suroviny, činidla a nástroje

ČerstvýCistanche tubulosamasité stonky byly sklizeny na podzim z Hotanu, Ujgurská autonomní oblast Xinjiang, Čína. RAW264.7 myší monocyt-makrofágová leukemická buněčná linie byla zakoupena od Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, Čína). Acetonitril a metanol v chromatografické kvalitě dodala společnost Merck (Německo). Referenční standardní látky echinakosid a akteosid (čistota větší nebo rovna 98 %) byly získány z Beijing North Weiye Metrology Technology Research Institute. Dimethylsulfoxid (DMSO) byl zakoupen od Sigma-VETEC (USA). DMEM médium s vysokým obsahem glukózy, souprava pro stanovení celkového proteinu BCA byly produkty společnosti Thermo Fisher Scientific (USA). Fetální bovinní sérum (FBS) bylo zakoupeno od BI (Izrael). Roztok dvojitých protilátek penicilin-streptomycin pochází od HyClone (USA). Komerční testovací soupravy pro NO, MDA, SOD, CAT, GSH byly získány od Beyotime Biotechnology (Shanghai, Čína). LDH detekční souprava a lipopolysacharid (LPS,E. coli055:B5) byly získány od Solarbio (Peking, Čína).

Mezi klíčové laboratorní přístroje patřil vysoce výkonný systém kapalinové chromatografie (HPLC) Shimadzu, rotační výparník LabTech, vysokorychlostní rozmělňovač čínských bylinek s výkyvným typem, termostatická pec pro vysoké sušení, zařízení pro parní hrnec, multimódová čtečka mikrodestiček BioTek SYNERGY-H1, elektronická analytická váha FA1204N, chlazená CF15,2 Skříň biologické bezpečnosti BSC‑1300IIA2 a inverzní optický mikroskop BDS200‑PH.

2.2 Experimenty jednofaktorového zpracování

ČerstvýCistanche tubulosamasité stonky byly nakrájeny na plátky různé tloušťky (0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm, 1,2 cm). Řezy byly napařeny po různou dobu (3 min, 6 min, 9 min, 12 min, 15 min, 18 min, 21 min). Poté byly materiály sušeny při různých teplotních gradientech (okolní 25 stupňů, 40 stupňů, 50 stupňů, 60 stupňů, 70 stupňů, 80 stupňů). Plně vysušené vzorky odvaru byly rozmělněny a prosety přes síto 40 mesh pro následnou kvantifikaci složek HPLC.

2.3 Stanovení obsahu akteosidů a echinakosidu

Příprava roztoku vzorku: Do zazátkované Erlenmeyerovy baňky přesně navažte 1,0 g práškového odvarového prášku. Přidejte přesně 100 ml 50% roztoku methanolu. Proveďte 30minutové namáčení a následně 40minutovou extrakci ultrazvukem. Po vychladnutí doplňte úbytek hmotnosti rozpouštědla 50% methanolem, rovnoměrně promíchejte a nechte usadit. Supernatant byl filtrován přes 0,22 um mikroporézní membránu pro HPLC injekci.

Příprava referenčního standardního roztoku: Přesně navážíme příslušné množství akteosidových a echinakosidových referenčních látek, rozpustíme v 50 % methanolu v odměrných baňkách, připravíme sériově gradientní standardní roztoky, přefiltrujeme filtrační membránou 0,22 μm.

Chromatografické uspořádání: analytická kolona COSMOSIL C1₈; systém mobilní fáze: mobilní fáze A: 0,1% vodný roztok kyseliny fosforečné; mobilní fáze B: acetonitril. Detekční vlnová délka byla nastavena na 330 nm; teplota kolony 35 stupňů; průtok 1 ml/min. Pro kvantitativní výpočet obsahu akteosidů a echinakosidu byla použita metoda externího standardu. Skóre komplexního hodnocení=(obsah echinakosidu × 50 %) + (obsah akteosidů × 50 %). Komplexní skóre sloužilo jako složený indikátor hodnocení pro výkonnost zpracování.

2.4 Experimentální design Box-Behnken Response-Surface

Na základě jednofaktorových experimentálních výsledků byl k implementaci Box-Behnken třífaktorového tříúrovňového experimentálního uspořádání použit software Design-Expert 13.0. Jako nezávislé proměnné byly zvoleny tloušťka řezu (X₁, cm), doba napařování (X₂, min), teplota sušení (X₃, stupeň ). Obsah akteosidů (Y1, %) a obsah echinakosidu (Y2, %) byly hodnoty odezvy. Bylo provedeno sedmnáct skupin experimentů. Nulová hladina pro každý faktor byla zvolena podle optimálního parametru získaného v jednofaktorových testech. Po dokončení zkoušek povrchu odezvy byla dokončena analýza rozptylu modelu, 3D vykreslování povrchu odezvy a predikce podmínek. Praktické ověřovací experimenty byly provedeny po úpravě teoretických předpokládaných parametrů na provozní skutečné výrobní hodnoty.

2.5 Buněčná kultura a příprava vzorku

Surovina odvaru byla vyrobena za optimalizovaných podmínek zpracování. Bylinný prášek byl extrahován podle výše uvedeného protokolu pro přípravu vzorku, zakoncentrován rotačním odpařováním a vakuově vysušen, aby se získal pevný extraktový prášek. Zásobní roztok byl připraven rozpuštěním práškového extraktu v DMSO, dále zředěn kompletním médiem DMEM (obsahujícím 10 % FBS a 1 % penicilin-streptomycin) pro buněčné experimenty; konečná pracovní koncentrace DMSO byla kontrolována pod 0,1 % (v/v). Makrofágy RAW264.7 byly kultivovány v kompletním médiu DMEM při 37 stupních, 5 % CO2 zvlhčeném prostředí inkubátoru.

2.6 Test cytotoxicity MTT

Buňky RAW264.7 byly nasazeny na 96jamkové mikrodestičky v buněčné hustotě 8 x 104 buněk/ml. Experimentální skupiny zahrnovaly kontrolní skupinu s rozpouštědlem (0,1 % médium DMSO), modelovou skupinu LPS (konečná koncentrace LPS 1 ug/ml) a mnohočetnéCistanche tubulosaskupiny koncentrace extraktu (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/ml). Po 2-hodinové preinkubaci s rostlinným vzorkem byl LPS (konečná koncentrace 1 ug/ml) doplněn do každé skupiny kromě kontrolní skupiny s rozpouštědlem. Inkubace pokračovala 24 hodin. Poté bylo přidáno činidlo MTT (5 mg/ml) a inkubováno po dobu 4 hodin. Odstraňte supernatant, přidejte 150 μl DMSO na jamku, protřepávejte při 37 stupních po dobu 15 minut. Hodnota absorbance při vlnové délce 490 nm byla odečtena na čtečce mikrodestiček a byla vypočtena rychlost přežití buněk. Pro následné funkční testy byl stanoven bezpečný rozsah pracovních koncentrací.

2.7 Intracelulární měření ROS

Makrofágy RAW264.7 byly naočkovány na šestijamkové destičky v hustotě 4 x 105 buněk na jamku. Po adherenci buněk bylo provedeno seskupení: kontrolní skupina s rozpouštědlem, modelová skupina LPS a skupiny s CT extraktem (12,5, 25, 50, 100 ug/ml). Po 2-hodinovém předběžném ošetření vzorkem byl přidán LPS 1 ug/ml kromě kontrolní skupiny s rozpouštědlem, inkubujte 24 hodin. Intracelulární hladina ROS byla detekována pomocí metody zavedení fluorescenční sondy podle návodu kitu. Intenzita fluorescence byla měřena čtečkou fluorescenčních mikrodestiček (excitace 488 nm, emise 525 nm).

2.8 Detekce NO, MDA, SOD, CAT, LDH a GSH

Po odpovídajícím ošetření buněk byl supernatant buněčné kultury odebrán pro měření NO pomocí Griessovy reakce. Připojené buňky byly promyty předem vychlazeným PBS, lyžovány na ledu, supernatant buněčného lyzátu byl sklizen po centrifugaci (10 000 r/min, 4 stupně, 5 min). BCA kit stanovil koncentraci celkového proteinu každého vzorku. Obsahy MDA, GSH a indikátorů enzymatické aktivity SOD, CAT, LDH byly stanoveny přesně podle provozních manuálů soupravy.

2.9 ELISA Stanovení prozánětlivých cytokinů

Buňky RAW264.7 dostávaly předběžnou úpravu vzorku a stimulaci LPS po dobu celkem 16 hodin. Supernatant buněčné kultury byl odebrán a odstředěn. Koncentrace TNF‑, IL‑1, IL‑6 v supernatantu byly kvantifikovány komerčními soupravami ELISA.

2.10 Analýza Western-Blot

Po 45 minutách LPS a společné inkubaci vzorku byly buňky RAW264.7 lyžovány pomocí lyzačního pufru RIPA doplněného koktejlem inhibitorů proteázy a fosfatázy. Buněčný lyzát byl centrifugován při 10 000 r/min při 4 stupních po dobu 5 minut. BCA kit kvantifikoval koncentraci celkového proteinu. Vzorkové proteiny (50 ug na dráhu) byly denaturovány při 100 stupňové kovové lázni po dobu 5 minut. SDS‑PAGE gelová elektroforéza separovala cílové proteiny, které pak byly přeneseny na PVDF membrány. Membrány byly blokovány po dobu 1 hodiny 5% roztokem TBST odstředěného mléka. Primární protilátky zacílené na p38, p‑p38, AKT, p‑AKT, JNK, p‑JNK, NF‑κB p65, p‑NF‑κB p65 a GAPDH byly inkubovány přes noc při 4 stupních. Po promytí TBST byly odpovídající sekundární protilátky inkubovány při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Po opakovaném promytí bylo pro zobrazení proteinového pásu aplikováno ultracitlivé chemiluminiscenční činidlo ECL. Pro hodnocení relativní hladiny exprese fosforylace-proteinu byla implementována pásová kvantitativní analýza ve stupních šedi.

2.11 Statistická analýza

Pro statistické výpočty a vykreslování grafů byl použit software GraphPad Prism 8.0.2. Výsledky experimentálních kvantitativních dat byly vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Pro meziskupinové srovnání byla použita jednocestná ANOVA následovaná post-hoc vícenásobným srovnávacím testem. \\(P<0.05\) represented statistically significant difference; \(P<0.01\) highly significant difference; \(P<0.001\) extremely significant difference.

3. Experimentální výsledky

3.1 Výsledky jednofaktorových experimentů

Slice thickness exerted obvious influence over the contents of acteoside and echinacoside. Slices at 0.2 cm thickness were easily over‑steamed, leading to thermal degradation of phenylethanoid‑glycoside active components. Excessively thick slices (>0,4 cm) brání vnitřnímu uvolňování látek, čímž se snižuje konečný detekovatelný obsah složek. Při pevné době napařování (10 minut) a teplotě sušení (60 stupňů) dosáhla tloušťka řezu 0,4 cm nejvyššího komplexního hodnocení.

Výsledky trvání ošetření napařováním: když byla tloušťka plátku fixována na 0,4 cm a teplota sušení byla udržována na 60 stupních, nedostatečná doba napařování nemohla dostatečně zničit strukturu rostlinných buněk, takže aktivní látky bylo těžké rozpustit. Jakmile doba napařování přesáhla 6 minut, nadměrné napařování poškodilo bylinnou tkáň a vyvolalo degradaci echinakosidu a akteosidu. Proto bylo 6 minut předběžně identifikováno jako výhodná doba zpracování v páře.

Pro experimenty s gradientem teploty sušení v peci: tloušťka plátku 0,4 cm a doba vaření v páře 6 minut. Obsah složek stoupal s rostoucí teplotou sušení v určitém rozmezí. Jakmile teplota sušení přesáhla 60 stupňů, vysokoteplotní tepelný rozklad způsobil výrazný pokles obsahu cílové látky. Proto bylo zvoleno 60 stupňů jako počáteční optimální teplota sušení pro následnou optimalizaci odezvy povrchu.

3.2 Box-Behnken Response-Surface Optimization and Verification

Podle návrhové matice bylo dokončeno 17 skupin experimentálních běhů Box-Behnken. Výsledky analýzy rozptylu ukázaly, že regresní modely pro obsah akteosidů i echinakosidu dosáhly statistické významnosti (\\(P<0.05\)). The lack‑of‑fit terms were non‑significant (\(P>0.05\)), demonstrating satisfactory model‑fitting quality. Coefficient of determination \(R^2\) values were close to 1, illustrating high consistency between predicted values and practical measured experimental data. Factor‑influence rank for acteoside yield: slice thickness > drying temperature > steaming time. Factor‑influence rank for echinacoside yield: steaming time > drying temperature >tloušťka plátku.

Pomocí modelového matematického výpočtu byly teoretické optimální parametry zpracování: tloušťka plátku 0,600 cm, doba napařování 5,685 min, teplota sušení 57,009 stupňů . Vzhledem k reálné proveditelnosti průmyslového provozu byly parametry upraveny na tloušťku plátku 0,6 cm, dobu paření 6 min, teplotu sušení 57 stupňů . Byly provedeny tři paralelní ověřovací experimenty. Za těchto praktických podmínek byl naměřen obsah akteosidů 7,25 %, obsah echinakosidu dosáhl 31,62 %. Odchylka mezi naměřenými hodnotami a teoretickou predikcí zůstala pod 5 %, což dokazuje, že tento model odezvového povrchu byl spolehlivý a použitelný pro řízení výroby kusového odvaru v reálném světě.

3.3 Screening cytotoxicity u Optimized-ProcessedCistanche tubulosaExtrahujte v buňkách RAW264.7

Výsledky cytotoxicity MTT odhalily, že koncentrace extraktu v rozmezí 0–100 ug/ml nevykazovala žádný zjevný toxický účinek na makrofágy RAW264.7 a dokonce vykazovala mírnou tendenci k podpoře buněčné proliferace. Když se koncentrace léčby vyšplhala na 200 ug/ml a 400 ug/ml, míra přežití buněk se významně snížila ve srovnání s kontrolní skupinou s rozpouštědlem, což ukazuje na koncentraci závislou cytotoxicitu. Proto byly koncentrační gradienty 12,5 ug/ml, 25 ug/ml, 50 ug/ml, 100 ug/ml vybrány jako bezpečné pracovní koncentrace pro následné buněčné testy související s oxidačním stresem a zánětem.

3.4 Cistanche tubulosaExtrahujte sníženou intracelulární hladinu ROS v makrofázích stimulovaných LPS

Ve srovnání s kontrolní skupinou s rozpouštědlem se intenzita intracelulární ROS fluorescence skupiny LPS modelu extrémně významně zvýšila (\\(P<0.001\)), confirming successful construction of cellular oxidative‑damage model. After intervention with gradient‑concentration Cistanche tubulosaintracelulární akumulace ROS klesala v závislosti na dávce. Každá drogová skupina vykázala statisticky významné snížení ROS oproti LPS modelové skupině (\\(P<0.001\)). This finding demonstrated that processed‑herb extract could effectively restrain excess ROS generation under inflammatory stimulation.

3.5 Účinky na obsah NO a MDA

NO slouží jako klasický zánětlivý mediátor uvolňovaný aktivovanými makrofágy. MDA je biomarker zlatého standardu odrážející oxidační poškození lipidové peroxidace. Ve srovnání s kontrolní skupinou s rozpouštědlem stimulace LPS výrazně zvýšila obsah NO a MDA v buňkách RAW264.7 (\\(P<0.001\)). Different dosages of Cistanche tubulosaúprava extraktem by mohla významně snížit koncentraci NO. Pro indikátor MDA: skupina 12,5 ug/ml nevyvolala statisticky významné zlepšení; Skupiny s koncentrací 25-100 ug/ml pozorovatelně snížily hladinu MDA (\\(P<0.001\)). The results illustrated that extracts alleviated LPS‑triggered lipid‑peroxidation injury and inflammatory‑mediator over‑production.

3.6 Dopady na biochemické indikátory související s antioxidanty SOD, CAT, LDH, GSH

Po stimulaci LPS se intracelulární SOD, CAT, LDH enzymatická aktivita a obsah GSH prudce snížily ve srovnání s kontrolní skupinou s rozpouštědlem (\\(P<0.001\)). Low‑dose (12.5 μg/mL) extract treatment could significantly raise SOD activity, but failed to generate prominent changes for CAT and LDH activity. Medium‑and‑high concentration groups (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) concentration‑dependently enhanced SOD, CAT, LDH enzyme activities and intracellular GSH content (\(P<0.001\)). It indicated that optimally‑processed Cistanche tubulosaExtrakty z odvarových kousků by mohly obnovit buněčnou endogenní antioxidační obrannou kapacitu proti oxidativním poškozením vyvolaným LPS.

3.7 Inhibiční účinek na uvolňování prozánětlivých cytokinů TNF-, IL-1, IL-6

Výsledky detekce ELISA ukázaly, že stimulace LPS silně podporuje sekreci TNF‑, IL‑1, IL‑6 z makrofágů RAW264.7 (\\(P<0.001\)). With the increase of Cistanche tubulosakoncentrace extraktu, množství uvolňování těchto tří klíčových prozánětlivých cytokinů bylo postupně potlačováno, což představuje jasnou korelaci mezi dávkou a odezvou. Potvrdilo se, že bylinný extrakt má silnou protizánětlivou funkci tím, že omezuje sekreci prozánětlivých cytokinů z aktivovaných makrofágů.

3.8 Regulace fosforylace signální dráhy p38/AKT/JNK/NF‑κB

Experimentální data Western blot ukázala, že poměry p‑p38/p38, p‑AKT/AKT, p‑JNK/JNK a p‑NF‑κB/NF‑κB byly významně zvýšené v modelové skupině LPS oproti skupině s rozpouštědlem (\\(P<0.001\)). Medium‑and‑high‑dosage Cistanche tubulosaextrakční zásah výrazně snížil poměr p-p38/p38 a p-JNK/JNK (\\(P<0.001\)). All concentration‑treatment groups obviously down‑regulated p‑AKT/AKT and p‑NF‑κB/NF‑κB phosphorylation level (\(P<0.05\) or \(P<0.001\)). These observations proved that Cistanche tubulosaextrakt z odvarových kousků zmírnil oxidačně-zánětlivé poškození prostřednictvím potlačení aktivace hyperfosforylace signální sítě p38/AKT/JNK/NF‑κB.

4. Diskuse

Tradiční požadavky na zpracování zaznamenané v čínském lékopisu proCistanche tubulosa mainly include impurity removal, washing, moistening, slicing and drying, without specifying precise numerical parameters for slice thickness, steaming duration and drying temperature. Non‑standard manual processing brings about large quality fluctuation of commercial decoction‑piece products. Phenylethanoid glycosides (echinacoside and acteoside) are thermally‑labile bioactive compounds. Improper heating time or temperature will trigger chemical decomposition and reduce medicinal value. Our single‑factor experiments revealed that both insufficient and excessive steaming as well as over‑high drying temperature would cause loss of target glycoside components. Further Box‑Behnken multi‑factor optimization obtained practical manufacturing parameters: slice thickness 0.6 cm, steaming 6 min, drying 57 ℃. Under this condition, acteoside and echinacoside content reached 7.25 % and 31.62 %, far exceeding pharmacopoeia minimum‑quality threshold. This optimized protocol provides feasible quantitative technical references for standardized industrial processing of Xinjiang‑origin Cistanche tubulosa.

Oxidační stres a zánět jsou úzce propojené patologické procesy. Nadbytek ROS indukuje peroxidaci lipidů a generuje MDA, který dále aktivuje vrozené imunitní makrofágy. Aktivované makrofágy secernují hojný NO a mnohočetné prozánětlivé cytokiny, které naopak zesilují intracelulární produkci ROS a vytvářejí samozesilující se oxidačně-zánětlivý bludný cyklus. Přírodní antioxidační látky rostlinného původu mohou tuto patologickou smyčku prolomit zvýšením endogenního antioxidačního enzymového systému a omezením přenosu zánětlivých signálů. V této in-vitro studii optimálně zpracovanéCistanche tubulosaExtrakty z odvarových kousků snížily hladiny ROS, NO a MDA a zároveň zvýšily aktivity SOD, CAT, LDH a obsah GSH v makrofázích RAW264.7 stimulovaných LPS. Současně inhiboval sekreci prozánětlivých cytokinů TNF-, IL-1, IL-6, což prokázalo integrovanou antioxidační-stresovou a protizánětlivou kapacitu.

Molekuly rodiny mitogenem aktivovaných proteinkináz p38, JNK spolu s AKT a NF‑κB tvoří centrální signální transdukční hub zprostředkovávající zánětlivo-oxidační reakce makrofágů. Po stimulaci LPS spouští upstream signál fosforylační aktivaci p38, JNK a AKT, která postupně podporuje fosforylaci podjednotky p65 NF‑κB a jadernou translokaci. Aktivovaný NF‑κB působí jako transkripční faktor a iniciuje transkripci velkých šarží prozánětlivých cytokinů a genů souvisejících s oxidativním stresem. Naše výsledky Western blot to ukázalyCistanche tubulosaextrakt by mohl potlačit fosforylaci p38, JNK, AKT a NF‑κB p65. Proto usuzujeme, že jeho antioxidační-stresové a protizánětlivé bioaktivity je dosaženo, alespoň částečně, blokováním nadměrné aktivace signální osy p38/AKT/JNK/NF-κB.

Současný výzkum má několik omezení. Všechna funkční ověření jsou omezena na úroveň buněčné kultury in vitro. K ověření farmakodynamického výkonu optimalizovaných kousků odvaru in vivo jsou nutné další experimenty in vivo na zvířecím modelu. Kromě toho tato studie přijala celkový smíšený extrakt z kousků odvaru, takže nemůžeme rozlišit individuální příspěvek echinakosidu, akteosidu a dalších menších sekundárních metabolitů. Následný výzkum může izolovat monomerní sloučeniny, aby se porovnala jejich účinnost proti oxidativnímu stresu, a provedl se výzkum účinku na kompatibilitu. Přesto naše současná práce stále poskytuje praktické parametry technologie zpracování a předběžné mechanické důkazy pro vývojCistanche tubulosasouvisející produkty zdravotní péče.

5. Závěr

Závěrem lze říci, že modernizovaný pracovní postup zpracování optimalizovaný metodikou Box-Behnken response-surface (tloušťka plátku 0,6 cm, vaření v páře 6 minut, teplota sušení 57 stupňů) může významně zvýšit obsah akteosidů a echinakosiduCistanche tubulosakousky odvaru. Extrakty připravené z těchto optimálně zpracovaných bylinných plátků vykazují výrazné antioxidační-stresové a protizánětlivé účinky proti poškození makrofágy RAW264.7 indukované LPS. Základní mechanismus koreluje s obnovou intracelulárního antioxidačně-obranného systému a inhibicí nadměrné aktivace zánětlivé signální dráhy p38/AKT/JNK/NF‑κB. Tato studie poskytuje solidní experimentální základ pro standardizovanou průmyslovou výrobu a využití funkčních potravinCistanche tubulosazdroje.

Reference

Lin J, Yu H, Zhao Y, a kol. Extrakce echinakosidu zCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight a zkoumání jeho ochranného účinku na poškození jater u potkanů ​​se sepsí. Food Sci Technol, 2023, 43:e010523.

Guo J, Tang S, Miao Y a kol. Protizánětlivé účinky lignanových glykosidů zCistanche tubulosapramení na LPS/IFN-indukovaných buňkách makrofágů RAW264.7 prostřednictvím dráhy PI3K/AKT. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2021, 22(10):1380-1391.

Rani V, Deep G, Singh RK a kol. Oxidační stres a metabolické poruchy: Patogeneze a terapeutické strategie. Life Sciences, 2016,148:183-193.

Park JH, Kim JH, Jang S I. Protizánětlivé působení dise‑necionyl cis‑khellaktonu v buňkách RAW264.7 stimulovaných LPS a jeho inhibiční aktivita na rozpustnou epoxidovou hydrolázu. Heliyon, 2023,9(10):e21032.

Chung YC, Song S J. Isobavachin zmírňuje lipopolysacharidy indukované zánětlivé reakce v makrofázích potlačením signálních drah MAPK a NF‑κB. Journal of Ethnopharmacology, 2024,321:117501.

He X, Li Y, Deng B. The PI3K/AKT signalling pathway in inflammation, cell death and glial scar formation after traumatic spinal‑cord injury. Cell Proliferation, 2022, 55(9):e13275.