Srovnávací studie chemických složek a obsahu Cistanche Tubulosa (Guanhua Roucongrong) a jejích zpracovaných produktů

Abstraktní

Objektivní:Prozkoumat variace (vzorce změny) v obsahu chemických složek zpracovaných produktůCistanche tubulosa(Guanhua Roucongrong).
Metody:Bylo vybráno pět druhů kousků odvaru, včetně syrových plátků, plátků dušených ve víně, plátků dušených, plátků zpracovaných s černými fazolemi a plátků zpracovaných šťávou z černých fazolí. Byla vytvořena metoda HPLC fingerprint a kombinována s hodnocením podobnosti, shlukovou analýzou (CA) a analýzou hlavních složek (PCA) pro screening a potvrzení rozdílů mezi surovým produktem a zpracovanými produkty. Chemometrické metody a HPLC byly použity ke stanovení a porovnání rozdílů v obsahu celkových fenylethanoidových glykosidů, polysacharidů, celkových flavonoidů a čtyř fenylethanoidových glykosidů mezi surovými a zpracovanými vzorky.
Výsledky:HPLC otisky prstůCistanche tubulosa and its processed products were established. With Mark peak matching, 9 common peaks were assigned for raw slices, whereas 11 common peaks were assigned for the other four processed products. Peaks No. 2 and No. 7 were differential chromatographic peaks. By comparison with reference standards, four chromatographic peaks were identified as echinacoside, cistanoside A, acteoside, and isoacteoside. Fingerprints of the processed products showed similar profiles with the same number of common peaks; similarity values were all >0,9. Při použití echinakosidu jako referenčního píku se RSD relativních retenčních časů společných píku mezi různými zpracovanými produkty pohybovala od 0,11 % do 0,82 %, zatímco RSD relativních ploch píku se pohybovala od 15,46 % do 76,07 %. Když byla vzdálenost mezi třídami nastavena na 10, CA klasifikovala surové plátky a zpracované produkty do tří kategorií. PCA indikovala rozdíly ve složení mezi surovými a zpracovanými vzorky: 11 proměnných píku bylo redukováno na tři hlavní složky; různé hlavní složky korelovaly s různými chromatografickými píky. Na základě matice složek a lineárního vážení komplexní skóre ukázalo, že plátky zpracované šťávou z černých fazolí a plátky dušené ve žlutém víně a na páře ve vodě se umístily výše. Obsahy v surových a zpracovaných vzorcích byly následující: celkové fenylethanoidové glykosidy 3,80 %–7,07 %, celkové polysacharidy 5,85 %–6,70 %, celkové flavonoidy 14,16 %–24,26 %; echinakosid 4,11 %–5,99 %, akteosid 0,67 %–1,34 %, cistanosid A 0,06 %–0,36 % a isoakteosid 0,25 %–1,66 %. Mezi zpracovanými produkty existovaly značné rozdíly.
Závěr:Zavedená metoda otisků prstů HPLC má silnou specifičnost, účinně odlišuje surové plátky od zpracovaných produktůCistanche tubulosaa je vhodný pro kvalitativní a kvantitativní analýzu echinakosidu, akteosidu, cistanosidu A a isoakteosidu v surovém léčivu a zpracovaných produktech. Srovnávací profilování a změny obsahu mezi různými vzorky mohou poskytnout vědecký základ pro identifikaci a kontrolu kvalityCistanche tubulosaa jeho různé zpracované produkty.

Klíčová slova: Cistanche tubulosa; zpracování; chemické složky; otisk prstu; vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC)

 

1 Úvod

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight (Guanhua Roucongrong) je vytrvalá bylina v Orobanchaceae a je oficiálně uvedeným zdrojem Cistanches Herba v lékopisu Čínské lidové republiky (dále jen „Čínský lékopis“). Léčivou částí je usušená dužnatá nať se šupinatými listy. Má teplou povahu, sladkou a slanou chuť a vstupuje do meridiánů ledvin a tlustého střeva, s funkcemi tonizujícího jangu ledvin, prospívá esenci a krvi a zvlhčuje střeva, aby zmírnil zácpu [1]. Moderní farmakologické studie potvrdily četné účinky, jako je anti-aging, posílení imunity, ledvinové tonizující a afrodiziakální účinky, projímavé účinky a antihypertenzní účinek.

Cistanche tubulosaje bohatý na fenylethanoidní glykosidy, iridoidy a jejich glykosidy, lignany, estery oligosacharidů, polyoly, polysacharidy, flavonoidy a další složky [2]. Mezi nimi jsou hlavními aktivními složkami a nejhojnějšími sloučeninami fenylethanoidové glykosidy; jsou také markerovými složkami pro stanovení obsahu v lékopisu a vykazují různé biologické aktivity, jako jsou antioxidační účinky, metabolická podpora, zlepšení učení a paměti a zlepšení sexuálních funkcí [3].

Cistanche tubulosapreferuje slano-alkalickou půdu a pouštní oblasti Gobi, parazituje na kořenechTamarixspp., a je distribuován hlavně ve Vnitřním Mongolsku, Sin-ťiangu a Gansu v Číně [4]. Divoké a kultivované geo-autentické oblasti zahrnují Minfeng County, Yutian, Pishan a Moyu v prefektuře Hotan, Xinjiang. Jeho zpracování se rozvíjí především na krájené odvarové kousky, surové bylinné materiály, extrakty, produkty pro zdraví a funkční potraviny; mezi těmito kusy komerčního odvaru zůstávají hlavním proudem. Na trhu se však různé zpracované produkty, jako jsou syrové plátky, plátky zpracované vínem, plátky inaktivované vysokoteplotními enzymy a plátky napařené vodou, často míchají a je obtížné je rozlišit.

Zpracování Cistanches Herba se postupem času vyvíjelo, od starověkých záznamů jako napřTaiping Shenghui Fang, Zhenglei BencaoaPuji Fang[5–7] (např. mytí vínem, smažení na víně, dušení/pečení na víně, namáčení/pečení nasucho s vínem, vaření ve vodě, trojité vaření v páře a smažení na másle) až po moderní metody, jako je macerace vína (paření), jednoduché vaření v páře, „čtyřpaření a opalování“ [8]. Různé metody zpracování mohou ovlivnit obsah aktivních složek, bezpečnost a biologickou aktivitu. Cai Hong a kol. [9] zjistili, že enzymová inaktivace čerstvého materiálu 70° horkou vodou po dobu 6 minut vedla k tomu, že obsah echinakosidu a akteosidu byl 7,3krát vyšší než obsah přímého sušení na slunci a 6,5krát vyšší. Tie Xiaoyan a kol. [10] uvedli, že zpracování v páře výrazně zlepšilo kvalitu kousků odvaru ve srovnání s čerstvými materiály. Chen Weijun a kol. [11] pozorovali, že obsah betainu se po zpracování vína, soli a páry ve srovnání s čerstvými produkty snížil. Zhang Chao a kol. [12] prokázali, že během paření vína s delší dobou paření echinakosid, akteosid, cistanosid A a 2′-acetylakteosid postupně klesaly, zatímco isoakteosid významně rostl.

Aktuální vydání čínského lékopisu z roku 2025 stanoví limity pouze pro echinakosid a akteosid v syrových plátcích a plátcích dušených ve víně, ale nespecifikuje složky markerů pro další zpracované produkty a postrádá účinné metody kontroly obsahu. Proto je analýza a porovnávání charakteristických složek a zkoumání vzorců změn složení zvláště důležité pro kvalitativní identifikaci a kvantitativní kontrolu surových a zpracovaných produktů.

Tradiční čínská medicína (TCM) otisky prstů představují holistické zastoupení chemických složek. S výhodami integrity, specifičnosti a bohatých informací je široce používán při hodnocení kontroly kvality surových léčiv a přípravků, sladění s mezinárodními standardy, identifikaci pravosti, monitorování výrobního procesu a výzkumu farmakodynamických látek [13]. Na základě HPLC fingerprintingu tato studie vybrala echinakosid, akteosid, cistanosid A a isoakteosid jako markery kvality a použila analýzu podobnosti, CA a PCA v kombinaci s určením obsahu k porovnání chemických složek a vzorců změn obsahu mezi různými zpracovanými produkty, což poskytuje vědecký základ pro identifikaci a kontrolu kvality.

 

2 Nástroje a materiály

2.1 Nástroje

U3000 HPLC systém (Thermo Fisher); UPL-111-20R systém ultračisté vody (Sichuan Youpu); elektronická váha AB 265-S (Mettler Toledo); KQ-5200DA ultrazvukový extraktor/čistič (Kunshan Ultrasonic); elektrická sušící trouba GZX-9240MBE (Shanghai Boxun); UV-2600 UV–Vis spektrofotometr (Shimadzu, Čína).

2.2 Léky a činidla

ČerstvýCistanche tubulosa(Šarže čCistanche tubulosa(Schenk) Wight (Orobanchaceae).

Referenční látky: D-glukóza bezvodá (číslo šarže. 361810, 100,00 %, Shenzhen Jinhui Biotechnology Co., Ltd.); echinakosid (číslo šarže. 111670-201907), rutin (číslo šarže. 100080-202012), akteosid (číslo šarže. 11530-202315), cistanosid A (číslo šarže. 313512) a isoakteosid (číslo šarže. 313413), s čistotou HPLC větší nebo rovnou 92,2 %, 9 %, 6 %, 9 %, 98,06 %, respektive 98,09 %, od Národního institutu pro kontrolu potravin a léčiv (Čína).(Poznámka: jeden řádek čistoty je v poskytnutém textu zkrácen; výše následuje za čitelnou částí.)

Žluté rýžové víno (polosuchý typ, alkohol 16%; Zhejiang Guyuelongshan Shaoxing Wine Co., Ltd.); methanol a acetonitril (HPLC čistota, Fisher Scientific, USA). Ostatní činidla byla analytické čistoty.

3 Metody a výsledky

3.1 Příprava syrových plátků a zpracovaných produktů zCistanche tubulosa

K přípravě syrových plátků a zpracovaných produktů byly použity následující metody, každý v 6 dávkách.

Syrové plátky:ČerstvýCistanchebyl nakrájen na 3 mm plátky a sušen při 60 stupních.

Metoda napařování:Podle literatury [14] bylo 20 g čistých plátků smícháno s 6 ml destilované vody v uzavřené nádobě, navlhčeno po dobu 4 hodin [12], napařeno nad vodou po dobu 12 hodin, ochlazeno a vysušeno na 60 stupňů.

Způsob zpracování vína:Připraveno podle metody dušení vína nebo vaření vína v páře (Všeobecné pravidlo 0213, Čínský lékopis).

Míchání s černými fazolemi:Připraveno podleČínská Materia Medica(Zhonghua Bencao) pod Cistanches Herba; černé fazole byly přidány v množství 1 kg na 10 kgCistanchemateriál.

Zpracování šťávy z černých fazolí:Plátky byly smíchány se šťávou z černých fazolí a poté zpracovány metodou vaření v páře výše; dávkování černých fazolí bylo stejné jako výše.

3.2 Stanovení položek kontroly

Vlhkost byla stanovena sušením v sušárně (General Rule 0832, Chinese Pharmacopoeia); celkový popel podle obecného pravidla 2302; extrakty rozpustné v alkoholu metodou macerace za studena podle obecného pravidla 2201. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

 

3.3 Srovnávací analýza otisků HPLCCistanche tubulosaa její zpracované produkty

3.3.1 Chromatografické podmínky

Kolona Waters Xterra RP18 (250 mm x 4,6 mm, 5 um). Mobilní fáze: acetonitril (A)–0,1 % kyselina mravenčí (B) s gradientovou elucí: 0–12 min, 14 % A → 17 % A; 12–30 min, 17 % A → 19 % A; 30–35 min, 19 % A → 14 % A; 35–50 min, 14 % A. Průtok: 1,0 ml·min⁻¹. Teplota kolony: 30 stupňů. Detekční vlnová délka: 330 nm. Objem nástřiku: 10 µL.

3.3.2 Příprava roztoků

Referenční řešení:Echinakosid, akteosid, cistanosid A a izoakteosidové referenční látky byly přesně zváženy a rozpuštěny v 50% methanolu v 10ml odměrných baňkách, aby se získaly roztoky 1,1301, 0,2294, 0,2255 a 0,2109 mg·mL⁻¹, v tomto pořadí zfiltrovány za získání konečných roztoků.

Vzorová řešení:0,5 g prášku 80 mesh surových a zpracovaných vzorků bylo přesně zváženo, extrahováno 50% methanolem v 25ml odměrné baňce, 40 min ochlazeno, mícháno, ponecháno stát a přefiltrováno přes 0,22 um membránu; byl použit filtrát.

3.3.3 Ověření metody (otisk prstu)

3.3.3.1 Přesnost

Stejný roztok vzorku byl injikován šestkrát po sobě. Při použití echinakosidu jako referenčního píku byla RSD relativních retenčních časů běžných píku<0.48% and the RSD of relative peak areas was <2.86%, indicating good instrumental precision.

3.3.3.2 Opakovatelnost

Ze stejné šarže (surový řez S1) bylo připraveno šest paralelních roztoků vzorků. Při použití echinakosidu jako referenčního píku byla RSD relativních retenčních časů<0.07% and the RSD of relative peak areas was <2.77%, indicating good method repeatability.

3.3.3.3 Stabilita

Stejný roztok vzorku byl analyzován po 0, 3, 6, 9, 12 a 24 hodinách. Při použití echinakosidu jako referenčního píku byla RSD relativních retenčních časů<0.11% and the RSD of relative peak areas was <2.33%, indicating stability within 24 h.

3.3.4 Zřízení otisků prstů

Třicet šaržíCistanche tubulosaa zpracované produkty byly analyzovány. Byl použit "Systém hodnocení podobnosti pro chromatografický otisk prstu tradiční čínské medicíny" (vydání 2012). Surový plátek S1 a plátek J1 dušený ve žlutém víně byly použity jako referenční otisky prstů; střední metoda a šířka časového okna 0,1 min byly použity pro vícebodovou korekci a Mark peak matching pro generování otisků prstů (obrázky 1–2) a byly získány překryté chromatogramy se smíšenými referenčními standardy (obrázek 3).

Výsledky ukázaly, že čtyři zpracované produkty měly profily otisků prstů podobné profilům syrových plátků. Syrové plátky měly 9 společných vrcholů, zatímco plátky zpracované v páře, na páře, míchané s černými fazolemi a černé fazole s džusem měly 11 společných vrcholů. Oba sdíleli devět společných vrcholů. Vrcholy č Profily otisků prstů mezi čtyřmi zpracovanými produkty byly podobné a jasně neodrážely rozdíly mezi nimi.

3.3.5 Analýza podobnosti

Using J1 as the reference fingerprint, similarity analysis was performed for different processed products (Table 2). Similarities were all >0,9, což ukazuje na podobné vlastnosti otisků prstů mezi různými zpracovanými produkty.

3.3.6 Identifikace společných vrcholů

Porovnáním retenčních časů se smíšenými referenčními standardy a chromatogramem surového plátku byly identifikovány čtyři chromatografické píky: pík 4, ​​echinakosid; Pík 9, cistanosid A; Vrchol 10, akteosid; Vrchol 11, isoacteosid (obrázek 2). S píkem 4 (echinakosid) jako referenčním píkem se hodnoty RSD relativních retenčních časů společných píku mezi různými šaržemi čtyř zpracovaných produktů pohybovaly od 0,11 % do 0,82 % a hodnoty RSD relativních ploch píku se pohybovaly od 15,46 % do 76,07 %.

3.3.7 Shluková analýza

SPSS 27.0 byl použit pro shlukovou analýzu surových plátků a zpracovaných produktů. Bylo použito meziskupinové spojení a byla použita čtvercová euklidovská vzdálenost (obrázek 4). Když byla mezitřídní vzdálenost<5, water-steamed slices and wine-steamed slices clustered together. When the inter-class distance was 10, raw slices and the four processed products were classified into three categories: raw materials (S1–S6) as one category; black-bean-juice-processed slices (H1–H6) as one category; and wine-steamed slices (J1–J6) together with water-steamed slices (Q1–Q6) and stir-processed-with-black-beans slices (C1–C6) as one category. When the inter-class distance was between 15 and 25, black-bean-juice-processed slices formed a separate cluster from the other samples.

3.3.8 Analýza hlavních komponent

Po standardizaci oblastí píku byla provedena PCA pomocí SPSS 27.0. Hodnota KMO byla 0,679 a významnost Bartlettova testu byla<0.001, indicating suitability for PCA. With eigenvalues >1 byly extrahovány tři hlavní složky s vlastními hodnotami 6,815, 1,987 a 1,105. Míra příspěvku rozptylu byla 61,954 %, 18,063 % a 10,047 %, s kumulativní mírou příspěvku rozptylu 90,064 % (tabulka 3). To znamená, že první hlavní složka je nejdůležitějším ukazatelem pro komplexní skóre.

Komponentní matice ukázala, že v první hlavní složce byly absolutní koeficienty proměnných plochy píku pro Peak 2–9 a Peak 11 relativně velké, což naznačuje silný vliv na F1. Druhá hlavní složka korelovala s informacemi píku 1 a 10 a třetí hlavní složka korelovala s píkem 1. Matice složek je uvedena v tabulce 4; suťový graf a graf zatížení jsou znázorněny na obrázcích 5 a 6. S použitím skóre tří hlavních složek a jejich podílů rozptylu jako vah pro lineární vážení byla vypočtena komplexní skóre (Tabulka 5), ​​což ukazuje, že plátky z černých fazolí zpracované šťávou, plátky na páře a plátky na páře se umístily výše.

 

3.4 Stanovení více složek pomocí HPLC vCistanche tubulosaa její zpracované produkty

3.4.1 Chromatografické podmínky a specifičnost

Chromatografické podmínky byly stejné jako pro snímání otisků prstů. Roztoky vzorků, referenční roztoky a negativní slepé roztoky (žluté rýžové víno, čištěná voda, šťáva z černých fazolí) byly každý injikovány (10 ul). Byly porovnány retenční časy. Negativní slepé roztoky nevykazovaly žádnou interferenci s echinakosidem, cistanosidem A, akteosidem a isoakteosidem.[text chybí ve zdroji]

3.4.2 Linearita

Referenční roztoky echinakosidu, akteosidu, cistanosidu A a isoakteosidu v koncentracích 1,1301, 0,2294, 0,2255 a 0,2109 mg·mL⁻1 byly přesně napipetovány při 1, 2, 4, 8, 10 a 16 µl. Lineární regrese byla provedena s plochou píku XXX proti injekční koncentraci YYY (mg·ml-1). Lineární rovnice a rozsahy jsou uvedeny v tabulce 6.

3.4.3 Přesnost

Stejný roztok vzorku byl injikován šestkrát po sobě. Hodnoty RSD obsahů pro čtyři analyty (echinakosid, cistanosid A, akteosid, isoakteosid) byly 0,23 %, 2,71 %, 0,53 % a 2,08 %, v tomto pořadí (tabulka 7).<3%, indicating good instrumental precision.

3.4.4 Opakovatelnost

Ze stejné šarže (surový řez S1) bylo připraveno šest paralelních roztoků vzorků. Hodnoty RSD obsahu pro čtyři analyty byly 0,22 %, 2,46 %, 0,50 % a 2,46 %, v tomto pořadí (tabulka 7).<3%, indicating good repeatability.

3.4.5 Stabilita (v rámci dne)

Stejný roztok vzorku byl analyzován po 0, 3, 6, 9, 12 a 24 hodinách. Hodnoty RSD obsahu pro čtyři analyty byly 0,80 %, 1,62 %, 1,72 % a 1,49 %, v tomto pořadí (tabulka 7).<2.0%, indicating stability within 24 h.

3.4.6 Stabilita (mezidenní)

Stejný roztok vzorku byl analyzován po dobu pěti po sobě jdoucích dnů. Hodnoty RSD obsahu pro čtyři analyty během pěti dnů byly 2,80 %, 2,53 %, 3,53 % a 2,88 %, v tomto pořadí (tabulka 7), což ukazuje na stabilitu během pěti dnů.

3.4.7 Obnova

Přiměřené množstvíCistanche tubulosavzorek byl zvážen a referenční standardy echinakosidu, akteosidu, cistanosidu A a isoakteosidu byly obohaceny v poměru 1:1. Bylo připraveno a analyzováno šest paralelních roztoků vzorků (injekce 10 ul). Průměrné výnosy byly 99,29 %, 98,75 %, 99,45 % a 96,13 % (n=6), s hodnotami RSD 2,51 %, 0,38 %, 1,71 % a 0,49 %.

3.4.8 Výsledky stanovení

Pro každý vzorek bylo přesně zváženo 0,5 g prášku; Bylo injikováno 10 ul pro stanovení a výpočet procentuálního obsahu čtyř složek. Výsledky jsou znázorněny na obrázcích 7–10.

 

3.5 Stanovení celkových fenylethanoidových glykosidů, celkových polysacharidů a celkových flavonoidů

3.5.1 Stanovení celkových fenylethanoidních glykosidů

3.5.1.1 Příprava referenčního roztoku

Vhodné množství echinakosidové referenční látky bylo přesně zváženo a rozpuštěno v methanolu v 10ml odměrné baňce, aby se získal roztok o koncentraci 0,32 mg.ml-1. Podle literatury [15] bylo odpipetováno 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 a 1,2 ml referenčního roztoku, zředěno na 10 ml methanolem a byla měřena absorbance (A) při 333 nm. Rovnice proložené standardní křivky byla Y=24.7596X+0.0147Y=24.7596X + 0.0147Y=24.7596X+0.0147, R2=0.9995R^2=0.9995R2=0.9995, s lineárním rozsahem 0,0029–0,0359 mg·mL⁻³

3.5.1.2 Příprava roztoku vzorku

100 mg vzorku prášku (protlačeno sítem 100 mesh) bylo přesně zváženo, extrahováno ultrazvukem methanolem po dobu 30 minut (200 W, 40 kHz), zředěno na 10 ml a přefiltrováno přes 0,22 um membránu. Poté bylo 0,2 ml filtrátu dále zředěno na 10 ml methanolem a mícháno pro analýzu.

3.5.1.3 Stanovení

Pro každý vzorek bylo použito 100 mg prášku k přípravě roztoku vzorku. Absorbance byla měřena při 333 nm a byl vypočten procentuální obsah celkových fenylethanoidových glykosidů (tabulka 9).

Rovnice (1):
Obsah (%) =C×V×Dm×100%= \\dfrac{C \\times V \\times D}{m} \\times 100\\%=mC×V×D​×100 %
kde CCC je koncentrace analytu v roztoku vzorku, VVV je objem ředění, DDD je faktor ředění a mmm je hmotnost vzorku (mg).

3.5.2 Stanovení celkových polysacharidů

3.5.2.1 Příprava referenčního roztoku

Vhodné množství bezvodé referenční látky D-glukózy bylo přesně zváženo, rozpuštěno v purifikované vodě a zředěno na 10 ml, aby se získal roztok 0,190 mg.ml-1. Po smíchání a filtraci (0,22 um) byly pipetovány 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 a 1,0 ml. Vyvolání barvy bylo provedeno metodou anthron–kyselina sírová [16]. Absorbance byla měřena při 625 nm. Rovnice proložené standardní křivky byla Y=35.1316X−0,0079Y=35.1316X - 0.0079Y=35.1316X−0,0079, R2=0.9957R^2=0.9957R2=0.9957, s lineárním rozsahem 0,0038–0,0190 mg¹mL.

3.5.2.2 Příprava roztoku vzorku

40 mg práškového vzorku bylo přesně zváženo, ultrazvukově rozpuštěno v čištěné vodě po dobu 30 minut (200 W, 40 kHz), zředěno na 10 ml a přefiltrováno přes 0,22 um membránu.

3.5.2.3 Stanovení

Pro každý vzorek bylo použito 40 mg k přípravě roztoku vzorku. Poté bylo odpipetováno 0,1 ml filtrátu a doplněno čištěnou vodou na 2,00 ml. Po vyvolání barvy metodou anthron–kyselina sírová byla změřena absorbance a vypočten procentuální obsah celkových polysacharidů (tabulka 8).

3.5.3 Stanovení celkových flavonoidů

3.5.3.1 Příprava referenčního roztoku

Vhodné množství referenční látky rutinu bylo přesně zváženo, rozpuštěno v 70% ethanolu a zředěno na 25 ml; filtrován přes 0,22 um membránu. Poté bylo odpipetováno 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 a 4,0 ml. Vyvolání barvy bylo provedeno metodou dusitan sodný–dusičnan hlinitý–hydroxid sodný [17]. Absorbance byla měřena při 510 nm. Rovnice proložené standardní křivky byla Y=11.5699X+0.0684Y=11.5699X + 0.0684Y=11.5699X+0.0684, R2=0.9989R^2=0.9989R2=0.9989, s lineárním rozsahem 0,0097–0,07386 mg·mL″.

3.5.3.2 Příprava roztoku vzorku

50 mg prášku bylo přesně zváženo, ultrazvukově rozpuštěno v 70% ethanolu po dobu 30 minut (200 W, 40 kHz), zředěno na 10 ml a přefiltrováno přes 0,22 um membránu.

3.5.3.3 Stanovení

Pro každý vzorek bylo použito 50 mg k přípravě roztoku vzorku. Potom bylo 0,5 ml filtrátu převedeno do 10 ml odměrné baňky a byly přidány barevné reagencie v pořadí, jak je uvedeno výše. Jako blank sloužila čištěná voda. Byla měřena absorbance a vypočten procentuální obsah celkových flavonoidů (tabulka 8).

 

4 Diskuse

V této studii byly HPLC otisky prstůCistanche tubulosa and its various processed products were established. Peak matching across different batches confirmed 9 common peaks in raw slices and 11 common peaks in processed products. By comparison with reference standards, four common peaks were identified as echinacoside, cistanoside A, acteoside, and isoacteoside. Similarity analysis showed that similarity values among four processed products were all >0,9 a celkové profily otisků prstů byly podobné, což naznačuje, že jejich typy složek byly blízké. Velké rozdíly v RSD relativních ploch píku však naznačují výrazné rozdíly v obsahu složek.

Ve srovnání se syrovými plátky vykazovaly čtyři zpracované produkty dva další píky (vrcholy 2 a 7), což naznačuje, že se chemické složky změnily po napařování vína, napařování ve vodě nebo zpracování černých fazolí. Předpokládá se, že tyto nově generované píky vznikly během zpracování; charakterizací jejich složek se budou zabývat následující studie.

Výsledky CA ukázaly, že když byla mezitřídní vzdálenost<5, wine-steamed and water-steamed slices clustered together, suggesting similar chemical composition and content. At an inter-class distance of 10, raw slices could be separated from black-bean-juice-processed slices, stir-processed-with-black-beans slices, and wine/water-steamed slices. At inter-class distances of 15–25, differences between black-bean-juice-processed slices and other samples became more prominent. PCA results indicated that three principal components had substantial influence on comprehensive evaluation.

Different processing methods directly affected the levels of various constituents. Na základě chemometrického stanovení byly celkové fenylethanoidní glykosidy klasifikovány jako: zpracované šťávou z černých fazolí > syrové plátky > dušené ve vodě > dušené ve víně > zpracované s černými fazolemi. Total polysaccharides ranked as: water-steamed > wine-steamed > stir-processed-with-black-beans > black-bean-juice-processed > raw slices. Total flavonoids ranked as: black-bean-juice-processed > water-steamed > stir-processed-with-black-beans > wine-steamed > raw slices. Compared with raw slices, black-bean-juice processing increased total phenylethanoid glycosides, whereas other processing methods decreased it; all four processing methods significantly increased total polysaccharides and total flavonoids. Mezi dvěma metodami černých fazolí zpracování šťávy z černých fazolí produkovalo větší zvýšení celkových fenylethanoidových glykosidů a celkových flavonoidů než zpracování s černými fazolemi se statistickými rozdíly.

 

Tabulka 8. Výsledky stanovení celkových fenylethanoidových glykosidů, celkových polysacharidů a celkových flavonoidů vCistanche tubulosaa její zpracované produkty

Zpracovaný produkt (kousky odvaru)	Celkové fenylethanoidové glykosidy (%)	Celkové polysacharidy (%)	Celkové flavonoidy (%)
Syrové plátky	6.81 ± 0.06	5.85 ± 0.10	14.16 ± 0.24
Plátky dušené na víně	5.10 ± 0.05***	6.61 ± 0.05***	20.84 ± 0.33***
Plátky dušené ve vodě	5.23 ± 0.05***	6.70 ± 0.15***	21.59 ± 0.37***
Zamícháme s plátky černých fazolí	3.80 ± 0.02***	6.56 ± 0.09***	21.02 ± 0.35***
Plátky zpracované z černých fazolí a šťávy	7.07 ± 0.09****	6.09 ± 0.03****	24.26 ± 0.18****

Poznámky: V porovnání s nezpracovanými řezy: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001; ve srovnání s plátky zpracovaných s černými fazolemi: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Echinakosid, akteosid, cistanosid A a isoakteosid jsou klíčové fenylethanoidové glykosidy přispívající k tonizujícím účinkům ledvin a příznivým účinkům esenceCistanche tubulosa. HPLC srovnání těchto čtyř složek ukázalo, že rozdíly v ploše píku mezi společnými píky mohou sloužit jako základ pro rozlišení různých zpracovaných produktů. Ve srovnání se syrovými plátky se echinakosid, cistanosid A a isoakteosid zvýšily v různé míře ve zpracovaných produktech, s výraznějším nárůstem u produktů ze šťávy z černých fazolí. Akteosid se snížil u tří zpracovaných produktů, ale zvýšil se u produktů zpracovaných s černými fazolemi. To může souviset s inherentní stabilitou akteosidu: jako fenylethanoidní diglykosid s kofeoylovou skupinou může podléhat štěpení esterové vazby při změnách teploty zahřívání, času a pH za vzniku kyseliny kávové a částečně isomerizovat na isoakteosid. Pozorované snížení akteosidu a zvýšení isoakteosidu ve čtyřech zpracovaných produktech může být spojeno s vysokoteplotním vařením v páře, což je v souladu se vzory uváděnými pro zpracování Rehmanniae Radix [18].

Echinakosid se v této studii zvýšil po vaření ve víně/vodě a zpracování černých fazolí, což je v rozporu s Zhang Chao et al. [12]. Při srovnání zpracování za míchání se zpracováním černých fazolí a zpracováním šťávy z černých fazolí ukázalo toto zpracování významně vyšší obsah echinakosidu a cistanosidu A a výraznější trend konverze z akteosidu na isoakteosid. Celkově tato studie odhaluje změny složení a obsahu po různých metodách zpracování a ověřuje změnu mezi akteosidem a isoakteosidem. Fingerprinty HPLC poskytují vědeckou metodu k identifikaci surových plátků a zpracovaných produktů a nabízejí referenci pro stanovení standardů kontroly kvality a pro kvalitativní a kvantitativní analýzy.

 

Střet zájmů

Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Autorské příspěvky

XU Xiaoqin: podpora projektu, návrh studie, experimentální stanovení a psaní rukopisů;
QING Degang: celková koordinace a sběr léčivých materiálů;
ZHANG Juan a ZHAO Peng'an: stanovení složek a analýza dat;
WANG Guoping: ověřování léčivých materiálů.

 

Továrna na vzorky Cistanche:

https://www.xjcistanche.com/about-us

 

 

Reference

[1] Lékopisná komise Ministerstva zdravotnictví Čínské lidové republiky.Lékopis Čínské lidové republiky[M]. Peking: Chemical Industry Press, 2025.
[2] Jia Xiaoguang, Ni Hui, Zhang Juan a kol. Stav výzkumu a průmyslového vývojeCistanche tubulosa [J]. Journal of Xinjiang Medical University, 2012, 35(7): 876–880.
[3] Liu Yuewen. Pokrok ve výzkumu fenylethanoidových glykosidů vCistanche tubulosa [J]. Současné zemědělské stroje, 2020(11): 60–62.
[4] Tu Pengfei. Přezkoumání bylinných textových důkazů pro Cistanches Herba [J].China Journal of Chinese Materia Medica, 2022, 47(20): 5670–5679.
[5] Zhu Su, Teng Shuo, Liu Chun.Puji Fang[M]. Peking: Lidové lékařské nakladatelství, 1959.
[6] Wang Huaiyin.Taiping Shenghui Fang[M]. Peking: Lidové lékařské nakladatelství, 1959.
[7] Tang Shenwei.Chongxiu Zhenghe Jingshi Zhenglei Beiyong Bencao[M]. Peking: Lidové lékařské nakladatelství, 1957.
[8] Zhang Yong, Wu Huan. Historický vývoj metod zpracování pro Cistanches Herba [J].China Journal of Chinese Materia Medica, 1992, 17(4): 213–214.
[9] Cai Hong, Bao Zhong, Jiang Yong. Technologie zpracování pro čerstvéCistanche tubulosa [J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2007, 32(13): 1289–1291.
[10] Tie Xiaoyan, Feng Yinping, Ma Dongni. Vliv zpracování v páře v původní oblasti na kvalitu pouštních Cistanches Herba [J].Časopis tradiční čínské veterinární medicíny, 2021, 40(2): 54–56.
[11] Chen Weijun, Jia Cuiyu, Li Lianjiang. Účinky různých metod zpracování na obsah betainu v Sin-ťianguCistanche tubulosa [J]. Zemědělské rekultivační lékařství, 2009, 31(5): 400–402.
[12] Zhang Chao, Hua Yue, Lian Jing a kol. Studie změn obsahu fenylethanoidových glykosidů během zpracování Cistanches Herba [J].Čínský žurnál informací o tradiční čínské medicíně, 2022, 29(4): 92–97.
[13] Wu Chunxing, Yang Yang, Meng Mei a kol. Stav výzkumu a analýza trendů otisků prstů TCM v posledním desetiletí [J].Journal of Minzu University of China (Natural Sciences Edition), 2024, 33(4): 63–72.
[14] Jiang Yong, Bao Zhong, Sun Yongqiang. Studium technologie zpracování řezů Cistanches Herba [J].Čínský farmaceutický časopis, 2011, 46(14): 1074–1076.
[15] Zhang Leihong, Du Niansheng, Wang Qing. Stanovení fenylethanoidových glykosidů v kapslích celkových glykosidů Cistanches Herba UV spektrofotometrií [J].Journal of Xinjiang Medical University, 2002, 25(4): 407–408.
[16] Ailadan·Maimaiti Aili, Yang Ting, Yuan Jie. Proces extrakce a in vitro antioxidační aktivita polysacharidů ze zbytkůCistanche tubulosa [J]. Čtvrtletník pro chemické a biochemické inženýrství(přeložený název časopisu podle čínštiny), 2020, 37(2): 36–41.
[17] Luo Yan. Optimalizace procesu extrakce celkových flavonoidů zCistanche tubulosa[D]. Shihezi: Univerzita Shihezi, 2015.
[18] Shan Guoshun, Zhao Qimiao, Li Rui a kol. Dynamické studium obsahu akteosidů během zpracováníRehmannia glutinosa [J]. Asijsko-pacifická tradiční medicína, 2019, 15(3): 37–39.